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1、專題3,植物組織培養(yǎng)技術(shù),2,,,,(一)組織培養(yǎng)定義,組織培養(yǎng)是指用無菌方法使植物體的離體器官、組織和細(xì)胞在人為提供的條件下生長和發(fā)育的所有培養(yǎng)技術(shù)的總稱，也稱之為離體培養(yǎng)。,一、基礎(chǔ)知識,4,（二）植物組織培養(yǎng)的分類 廣義的組織培養(yǎng)依外植體不同，可分為： 1) 器官培養(yǎng)（organ culture） 2)莖尖分生組織培養(yǎng)(shoot tip culture, apical meristem culture) 3)愈傷組織培養(yǎng)(calluse cultrue) 4)細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture) 5)原生質(zhì)體培養(yǎng)(protoplast culture),,,,（二）植物組織培養(yǎng)應(yīng)用領(lǐng)域

2、 1、快速繁殖： 運用組織培養(yǎng)的途徑，一個單株一年可以繁殖幾萬到幾百萬個植株。例如一株蘭花一年繁殖到400萬株。 2、種苗脫毒 ： 針對病毒對農(nóng)作物造成的嚴(yán)重危害，通過組織培養(yǎng)可以有效地培育出大量的無病毒種苗。 3、遠(yuǎn)緣雜交： 利用組織培養(yǎng)可以使難度很大的遠(yuǎn)緣雜交取得成功，從而育成一些罕見的新物種。,4、突變育種： 采用組織培養(yǎng)可以直接誘變和篩選出具抗病、抗鹽、高賴氨酸、高蛋白等優(yōu)良性狀的品種。 5、基因工程： 基因工程主要研究DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后必須通過組織培養(yǎng)途徑才能實現(xiàn)植株再生。 6、生物制品： 有些極其昂貴的生物制品，如抗癌首選藥物--紫杉醇等，可通過組織培養(yǎng)方式生產(chǎn)。,（三）

3、植物組織培養(yǎng)的基本過程,(四) 植物的組織培養(yǎng)的有關(guān)概念,1.細(xì)胞的分化,（1）概念：,在個體發(fā)育中，相同細(xì)胞的后代在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理功能上發(fā)生穩(wěn)定性差異的過程,（3）結(jié)果：,形成不同的細(xì)胞和組織,（2）原因：,基因在特的時間和空間條件下的選擇性表達(dá)的結(jié)果,（4）特點：,穩(wěn)定性：,全能性：,持久性：,是一種持久性的變化，它發(fā)生在生物體的整個生命過程中,在胚胎期達(dá)到最大限度,細(xì)胞分化是穩(wěn)定的，一般是不可逆轉(zhuǎn)的,已分化的細(xì)胞，仍具有發(fā)育的潛能,2.細(xì)胞的全能性,定義：,生物體的細(xì)胞具有使后代細(xì)胞形成完整個體的潛能的特性,原因：,生物體的每一個細(xì)胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)，都有發(fā)育成為完整

4、個體所必需的全部基因,高度分化的動物細(xì)胞，從整個細(xì)胞來說，全能性受到限制。但它的細(xì)胞核仍然保持著全能性。,已分化的植物細(xì)胞，仍具有全能性,實例,受精卵生殖細(xì)胞體細(xì)胞,全能性的比較:,1.什么叫外植體？ 2.什么叫愈傷組織？ 3.愈傷組織的細(xì)胞有什么特點？ 4.什么叫脫（去）分化、再分化？ 5.如何控制細(xì)胞的脫分化與去分化？,思考題：,從活植物體上切下進(jìn)行培養(yǎng)的那部分細(xì)胞、組織或器官,在人工培養(yǎng)基上由外植體上形成的一團(tuán)無序生長狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。,細(xì)胞排列疏松而無規(guī)則,是高度液泡化的、成無定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞,人參的愈傷組織,菠蘿的愈傷組織,（六）影響植物組織培養(yǎng)的因素,1.植物材料的選擇,例如：煙草

5、和胡蘿卜的組織培養(yǎng)較為容易； 枸杞愈傷組織的芽誘導(dǎo)比較難,同一種植物材料，其年齡、保存時間的長短也會影響實驗結(jié)果,例如：菊花的組織培養(yǎng)一般選擇未開花植株的莖上部新萌生的側(cè)枝,不同的植物組織，培養(yǎng)的難易程度不同,2.不同的離體組織和細(xì)胞對營養(yǎng)、環(huán)境等條件的要求相對特殊，需配置不同的培養(yǎng)基,MS培養(yǎng)基主要成分包括：,A、大量元素: C、H、O、N、P、 S 、 K、Ca、Mg,B、微量元素: B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co,C、有機(jī)物： 甘氨酸、煙酸、肌醇、維生素、蔗糖等 D、植物激素：生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素等,討論：你能說出各種營養(yǎng)物質(zhì)的作用嗎？同專題2中微生物培養(yǎng)基的配方相比

6、，MS培養(yǎng)基的配方有哪些明顯的不同？,答：微量元素和大量元素提供植物細(xì)胞生活所必需的無機(jī)鹽；蔗糖提供碳源，同時能夠維持細(xì)胞的滲透壓；甘氨酸、維生素等物質(zhì)主要是為了滿足離體植物細(xì)胞在正常代謝途徑受到一定影響后所產(chǎn)生的特殊營養(yǎng)需求。微生物培養(yǎng)基以有機(jī)營養(yǎng)為主。與微生物的培養(yǎng)不同，MS培養(yǎng)基則需提供大量無機(jī)營養(yǎng)，無機(jī)鹽混合物包括植物生長必須的大量元素和微量元素兩大類。,,常用的植物激素：生長素、細(xì)胞分裂素和赤霉素,生長素類：,2，4二氯苯氧乙酸（2，4D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）,細(xì)胞分裂素類：,激動素（KT）、6芐基嘌呤（ 6BA）、玉米素（ZT）,赤霉素類：,赤

7、霉酸（GA3）,3.植物激素的影響,生長素和細(xì)胞分裂素作用,植物中生長素和細(xì)胞分裂素是啟動細(xì)胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵性激素。在生長素存在的情況下，細(xì)胞分裂素的作用呈現(xiàn)加強(qiáng)的趨勢,有利于根的分化,有利于芽的分化，抑制根的分化,促進(jìn)愈傷組織生長,生長素和細(xì)胞分裂素同時使用，用量的比例對植物細(xì)胞發(fā)育方向的影響,4、消毒 在培養(yǎng)的整個過程中，都需要是一個無菌環(huán)境。 5、pH、溫度、光照 菊花： pH=5.8 溫度控制在1822 每日光照12h,制備MS固體培養(yǎng)基,外植體消毒,接種,培 養(yǎng),栽 培,,,,,二、實驗操作,移 栽,,,沖洗酒精無菌水沖洗氯化汞無菌水沖洗至少三次之上,（一）制備MS固體

8、培養(yǎng)基,MS培養(yǎng)基包括20多種營養(yǎng)成分，實驗室一般使用4。C保存配制好的培養(yǎng)基母液來制備,無機(jī)物中大量元素濃縮10倍，微量元素濃縮100倍，常溫保存,激素類、維生素類以及用量較小的有機(jī)物一般可按1mg/ml的質(zhì)量濃度單獨配制成母液,用母液配制培養(yǎng)基時，需要根據(jù)各種母液的濃縮倍數(shù)，計算用量,1、配置各種母液,2、配置培養(yǎng)基,分裝到錐形瓶中，每瓶分裝50ml或100ml, 配制培養(yǎng)液, 調(diào)PH,培養(yǎng)基的分裝,由于菊花的莖段的組織培養(yǎng)比較容易，因此不必添加植物激素,3、滅菌,分裝好的培養(yǎng)基連同其他器械一起進(jìn)行高壓蒸汽滅菌,1、選材：菊花莖段，取生長旺盛的嫩枝,（二）外植體消毒,2、消毒,流水沖洗,菊

9、花莖段用流水沖洗后可加少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗后在流水下沖洗20min左右, 酒精處理,用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入體積分?jǐn)?shù)為70的酒精中搖動23次，持續(xù)67s，立即將外植體取出，在無菌水中清洗,消毒液處理,取出后用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1的氯化汞溶液中12min，取出后在無菌水中至少清洗3次，漂凈消毒液,（三）接種,污染的主要來源是空氣中的細(xì)菌和孢子，接種室消毒是至關(guān)重要的。用70的酒精噴霧使空氣消毒， 酒精或新潔爾滅搽洗工作臺并用紫外線照射20分鐘,1、接種室消毒,2、無菌操作要求,操作要在酒精燈火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼燒滅菌

10、，接種后立即蓋好瓶蓋。,3、材料的切取和接種,4、接種注意事項,每接種一塊外植體前，鑷子需放入體積分?jǐn)?shù)為75的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精燈火焰上燒一遍，冷卻后再接種,外植體在培養(yǎng)基中要分布均勻，放置外植體數(shù)量根據(jù)錐形瓶的大小確定，一般胡蘿卜34塊，菊的莖或葉68塊，也不要太少，以充分利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和光照條件,插入時應(yīng)注意方向，不要倒插。莖段、莖尖基部插入培養(yǎng)基利于吸收水分和養(yǎng)分,思考： 你打算做幾組重復(fù)？你打算設(shè)置對照實驗嗎？,答：每種材料或配方至少要做一組以上的重復(fù)。設(shè)置對照實驗可以取用一個經(jīng)過滅菌的裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，與接種操作后的錐形瓶一同培養(yǎng)，用以說明培養(yǎng)基制作合格，沒有被

11、雜菌污染。,（四）培養(yǎng),1、愈傷組織的培養(yǎng),從接種外植體到出現(xiàn)愈傷組織需經(jīng)過2周時間。2周之內(nèi)可以看到外植體上逐漸長出乳白色或黃白色的瘤狀愈傷組織。首次培養(yǎng)愈傷組織時，恒溫箱的門應(yīng)該關(guān)閉不必見光，因為在無光條件下愈傷組織長的更快。2周后，培養(yǎng)基成分接近耗盡，必須更換培養(yǎng)基，進(jìn)行繼代培養(yǎng),繼代培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)愈傷組織的相同，在嚴(yán)格的無菌條件下，將愈傷組織連同原來的外植體一起移到新培養(yǎng)基上。愈傷組織的繼代培養(yǎng)一代為20d。如果延長時間，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)減少，外植體會分泌有毒物質(zhì)，造成自身中毒。如果愈傷組織長到直徑為11.5cm時，就可以進(jìn)行試管苗培養(yǎng)，否則還需進(jìn)行第二代繼代培養(yǎng),2、愈傷組織

12、的繼代培養(yǎng),在愈傷組織繼代培養(yǎng)期間，將恒溫箱的門打開，讓愈傷組織見光，愈傷組織見光后顏色可以轉(zhuǎn)為綠色,3、試管苗的培養(yǎng),當(dāng)愈傷組織長到一定大小后，可以更換培養(yǎng)基，進(jìn)行試管苗的見光培養(yǎng),（五）移栽,移栽生根的菊花試管苗之前，應(yīng)先打開培養(yǎng)瓶的封口膜，讓試管苗在培養(yǎng)間生長幾日,1、打開封口膜,2、清洗轉(zhuǎn)移,用流水清洗根部的培養(yǎng)基，將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境下生活一段時間,3、移栽,珍珠巖：固體基質(zhì)型，含水量高、蓄水性強(qiáng)、透性好，適合栽培,幼苗長壯后，移栽到土壤中,（六）栽培,幼苗移栽后，每天觀察并記錄幼苗的生長情況，適時澆水、施肥，直至開花,此時的組織或細(xì)胞為離體的，即細(xì)胞所生活的環(huán)境為

13、液體有機(jī)物營養(yǎng)環(huán)境，而不是能體現(xiàn)其整個植物體的光能自養(yǎng),在培養(yǎng)過程中，是脫分化、再分化的過程，隨著芽和根的形成，就具有了自養(yǎng)的能力，是由細(xì)胞到一個個體的演變過程,1、高等植物是光能自養(yǎng)型生物，為什么在植物組織培養(yǎng)過程中還需要提供有機(jī)物培養(yǎng)基？,2、培養(yǎng)過程中為什么需要進(jìn)行光照,思 考,？,1、培養(yǎng)基的滅菌（高壓蒸汽滅菌） 2、外植體的消毒（酒精、氯化汞） 3、接種的無菌操作（酒精、酒精燈灼燒） 4、無菌箱中的培養(yǎng)； 5、移栽到消過毒的環(huán)境中生存一段時間。,1、在整個操作過程中，是如何來實現(xiàn)無菌環(huán)境的？,三、結(jié)果分析與評價,（一）對接種操作中污染情況的分析 （二）是否完成了對植物組織的脫分化和再

14、分化 （三）是否進(jìn)行了統(tǒng)計、對照與記錄 （四）生根苗的移栽是否合格,四、課題延伸,1、一般來說，容易進(jìn)行無性繁殖的植物，也容易進(jìn)行組織培養(yǎng),2、實例：蘆薈、豆瓣綠、秋海棠、月季,1、植物學(xué)家將胡蘿卜的韌皮部細(xì)胞分離出來，將單個細(xì)胞放在特定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得了許多完整的植株，這些植株的特點是( ) .彼此性狀極為相似.都是單倍體植株 .植株的變異頻率較高.都是純合體植株,2、根據(jù)分裂潛能，干細(xì)胞可分為全能干細(xì)胞（可發(fā)育成完整的個體）、多能干細(xì)胞（可發(fā)育成多種組織和器官）和專能干細(xì)胞（發(fā)育成專門的組織和器官），則這些細(xì)胞在個體發(fā)育中的分化順序是( ) .全能專能多能 .全能多能專能 .多能全能專

15、能 .專能全能多能,練 習(xí),,,21.下圖是植物組織培養(yǎng)的簡略表示。據(jù)此回答： ,,,3、下圖是植物組織培養(yǎng)的簡略表示。據(jù)此回答： （1）表示__________________，它能被培養(yǎng)成為的根本原因是______________________________________。 （2）表示____________，它與相比分化程度____________，全能性____________。 （3）若想制成人工種子，應(yīng)選用____________。 （4）若是花藥，則是____________，繼續(xù)對其使用____________處理可獲得____________正常植株，該過程稱為____

16、________。 （5）若是胡蘿卜根尖細(xì)胞，則培養(yǎng)成的葉片的顏色為____________，這說明____________。 （6）若利用此項技術(shù)制造治療燙傷、割傷的藥物紫草素，培養(yǎng)將進(jìn)行到____________。,答案： （1）離體的植物組織或器官 植物細(xì)胞具有全能性 （2）愈傷組織 低 高 （3） （4）單倍體植株 秋水仙素 純合體 單倍體育種 （5）綠色 含有表達(dá)葉綠體的基因 （6）,4、 基因型為AaBb的水稻（含24條染色體）的花藥通過無菌操作接入試管后，在一定條件下形成試管苗，問： （1）愈傷組織是花粉細(xì)胞不斷分裂后形成的不規(guī)則的細(xì)胞團(tuán)，愈傷組織形成過程中，必須從培養(yǎng)基中獲得

17、_____________等營養(yǎng)物質(zhì)。 （2）要促進(jìn)花粉細(xì)胞分裂生長，培養(yǎng)基中應(yīng)有_____________和_____________兩類激素。 （3）愈傷組織分化是指愈傷組織形成芽和根，再由芽發(fā)育成葉和莖。這一過程必須給予光照，其原因是_____________能利用光能制造有機(jī)物，供試管苗生長發(fā)育。 （4）試管苗的細(xì)胞核中含_________條脫氧核糖核苷酸鏈。 （5）培育成的試管苗可能出現(xiàn)的基因型有_____________。,答案： （1）水、無機(jī)鹽、維生素和小分子有機(jī)物 （2）細(xì)胞分裂素 植物生長素 （3）葉綠體 （4）24 （5）AB、aB、Ab、ab,課后練習(xí)： 1.答：植物組織培養(yǎng)所利用的植物材料體積小、抗性差，對培養(yǎng)條件的要求較高。用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基同樣適合于某些微生物的生長，如一些細(xì)菌、真菌等的生長。而培養(yǎng)物一旦受到微生物的污染，就會導(dǎo)致實驗前功盡棄，因此要進(jìn)行嚴(yán)格的無菌操作。 2.答：外植體的生理狀態(tài)是成功進(jìn)行組織培養(yǎng)的重要條件之一。生長旺盛的嫩枝生理狀況好，容易誘導(dǎo)脫分化和再分化。,方法：酶解法 在溫和條件下，用纖維素酶、果膠酶分解,物理法：離心、振動、電刺激等 化學(xué)法：用聚乙二醇（PEG）等試劑作為誘導(dǎo)劑 包括膜融合和核融合,形成多種雜種細(xì)胞 AA、AB、BB等,,植物組織培養(yǎng)的過程,,