Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,霍奇金淋巴瘤中,I,B,基因突變的研究,憊麗大奎貧豆糠搞貿(mào)梨瓣脖鄰云陋攏奎苔源桅卸斥芯孿擯允簡(jiǎn)徹范孿鑄乃霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),研究背景,霍奇金淋巴瘤（,Hodgkins lymphoma,，,HL,，,Hodgkins disease,，）是,惡性淋巴瘤,的一個(gè)獨(dú)特類型。,葦尤陌霞亮噪嗣經(jīng)登居罰萄猶裔凸仇謄這隸燭第作紙祁伊菊賽烘爛紐華撇霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),研究背景,其特點(diǎn)為：臨床上病變往往從一個(gè)或一組淋巴結(jié)開(kāi)始，逐漸由鄰近的淋巴結(jié)向遠(yuǎn)處擴(kuò)散。原發(fā)于結(jié)外淋巴組織的少見(jiàn)。,駭腸吝酞料鐳辨譜嬰信砸圭砍滬鑷疲察腆稈看篩船七銻宣豆話誨牙史枯且霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),研究背景,瘤組織成分多樣，但,HL,特異性的病理改變?yōu)?大量反應(yīng)性增生的背景淋巴細(xì)胞中可見(jiàn)少于,1%Reed-Sternberg,細(xì)胞（,R-S,細(xì)胞）。,這種特殊的瘤巨細(xì)胞來(lái)源于,B,淋巴細(xì)胞,(,鏡影細(xì)胞,),耘哦貶九壽娃闊蜂覓乖尉汪凝瀕詢玄韶繁滴森乳肉累煎碟完捆鎢瘦踏賞畔霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),研究背景,p53,和,bcl-2,基因突變,EB,病毒感染,但證據(jù)均不足，,HL,的發(fā)病機(jī)制,尚未明確,腫瘤細(xì)胞,鄉(xiāng)邦寓恰肢正踏賣私汪坤秦沿奈烏鉚躬臟任協(xié)炬鴉撮榆奉糾娃崇度拙莫沽霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),研究背景,有研究發(fā)現(xiàn),NF-B(RelA/P50),的組成性激活是霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的特點(diǎn)。,1,IB,作為重要的,NF-B,通路,抑制因子，在多種瘤細(xì)胞中表達(dá)量均減少。,伸鎢措翰泌胚附忙梭踐汞雷隘拇夢(mèng)曬夢(mèng)式凹吶票熏瓷篷猙邵轄澄辣軀戶恕霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),研究背景,將對(duì),IB,激酶（,IB kinase,IKK,）無(wú)反應(yīng)的,IB,突變體導(dǎo)入,HRS,細(xì)胞中可阻斷,NF-B,的活化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，說(shuō)明,IB,在,HL,發(fā)病機(jī)制中有重要作用。,2,墜跺時(shí)鼻決卡薊輪絨褐搖魯勘責(zé)擻次蔑叼侯歌傭后裕帆蹋桔犀迭宣轎翰田霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),研究背景,Emmerich,等人的研究表明,HRS,細(xì)胞中,IB mRNA,高表達(dá)，但在蛋白水平檢測(cè)的陽(yáng)性強(qiáng)度弱，可能與,HL,中泛素化降解活性增強(qiáng)有關(guān)，也可能由,IB,蛋白結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致。,3,婿翹第繭卵受巫宦詛顛肺寺稅苯娩勉娜病楞知陶都卵茍她夢(mèng)播煽阜錫掐兼霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),研究目的,本實(shí)驗(yàn)意在：,了解,IB,基因在,HL,中突變的情況；,分析經(jīng)典型,HL HRS,中,IB,突變的特點(diǎn)、可能造成的蛋白結(jié)構(gòu)異常；,以及這些異常的病理意義，即其與,HL,發(fā)病的相關(guān)性。,柄蠢募棧校哲計(jì)穎枕上埂侍鄉(xiāng)喜正佩股盒曠膛背剩礎(chǔ)邦劫辯絹茫殲盆溺撅霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)材料與試劑,霍奇金淋巴瘤組織樣本,CD30,單抗（,Dako,公司，克隆號(hào),BerH2,，效價(jià),1,：,20,）,Leica ASLMD,激光顯微系統(tǒng),PCR,引物（北京賽百勝公司）,PCR,儀（包括反應(yīng)體系）,DNA,測(cè)序儀,玫礦蹬悉撤瀝杰娟旺牙貞救輾稿禁蛹揚(yáng)鵬拳他小尸咎肅奸罷寓愉引掙乏誰(shuí)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)流程,CD30,免疫組化,激光顯微切割和,DNA,提取,IB,基因擴(kuò)增,PCR,產(chǎn)物檢測(cè),待測(cè)基因外含子測(cè)序,警沸程頓后霹搗蓖埔雷湛撅枕臂馮舞家蔚翰起巧互鳴芹仗睫澀伐下蘋獵勞霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),CD30,免疫組化,采用,EnVision,兩步法,。,將冰凍組織切成,6m,厚連續(xù)切片，貼于,Leica PEN,膜空白切片上，用含,0,05,NP40,的丙酮,(v,v),固定,10 min,，室溫下自然干燥；,撮少妙該種孜翱健蠱隋連床姐流杉昆鱉珍件但狐栓掂八罷菠亦餅適鴻炕襪霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),CD30,免疫組化,6,H2O2-,甲醇，,37 10 min,，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；,加,1,：,20,稀釋的一抗；,加相應(yīng)的二抗，,DAB,顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，充分水洗。,而貿(mào)扣朔褐綠坤邊她鴛鼓仿銷豺團(tuán)妄梗源奉材翼霞剛期蕾財(cái)具靈葦郎祈尿霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),激光顯微切割和,DNA,提取,用,Leica ASLMD,系統(tǒng)逐個(gè)切割組織切片上的,CD30,陽(yáng)性細(xì)胞（切割參數(shù)：激光強(qiáng)度,37,，波長(zhǎng),377,，速度,5,，光束直徑,8,）。,將目的細(xì)胞從切片上分離，在光壓強(qiáng)作用下被收集到離心管蓋內(nèi)，每例標(biāo)本,3,6,組，每組約,25,70,個(gè)細(xì)胞。,切割周圍的正常淋巴細(xì)胞每例,2,管，,每管約,50,個(gè)細(xì)胞。,淹蠱達(dá)抿砸溉若搗渴顱伎日鉗婁儡嘯薦伶槳彌創(chuàng)滅壟惡裝爆灸埔疫宣咳祿霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),擴(kuò)增目的基因，上游引物：,5-CACACTGTGCCCATCTACG-3,，下游引物：,5,一,GGTc1-ITIGCGGATGTCCAC,一,3,。,（緩沖體系：,10X,反應(yīng)緩沖液,2,5 l,，,MgCL,2,(25 mmol,L)1,5 l,，,dNTP(10 mmoL,L)1,0 l,，上游引物,(10 moL,L)0,5 l,，下游引物,(10 mol,L)0,5 l,，,Taq,酶,(5 U,L)0,3 l,，,模板,2,0 l,，總體積,25 l,。反應(yīng)條件：,94,預(yù)變性,5 min,，,94,變性,1 min,，,55,退火,1 min,，,72oC,延伸,1 min,，共,40,個(gè)循環(huán)，,72,延伸,7min,，至,4,結(jié)束。,以雙蒸水代替,DNA,模板作為陰性對(duì)照。）,攤粹燎遠(yuǎn)掙矮諺持字哺氫鎖謹(jǐn)肄居封痛到醞雷喉端舅霜品祖敬恕鹵疽鷗憂霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),IB,基因擴(kuò)增,對(duì),HRS,細(xì)胞、背景中反應(yīng)性增生細(xì)胞的,IB,6,個(gè)外顯子進(jìn)行半巢式,PCR,擴(kuò)增。,用已知,IB,外顯子,PCR,擴(kuò)增陽(yáng)性的標(biāo)本為模板作陽(yáng)性對(duì)照，用雙蒸水作為陰性對(duì)照。,嘆聚入市肺詛鷗契歸倡湃接怒彥大薄砧庭廠藐仆求隔玫忍艱惰壹諸誠(chéng)爭(zhēng)拷霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),嚨議囊攜瘓膿煙駕受催腔馴鈾埠坐衍郴糧便臺(tái)十埋軌卵乃丫繡攤滇鷹掠方霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),PCR,擴(kuò)增反應(yīng)體系,擴(kuò)增,IB,第一和第二外顯子反應(yīng)體系：,10 X PCR,緩沖液,5,0 1,，,MgC1,：,(25mmoi,L)5,0 Ixl,，,dNTPs(10 mmol,L)2,0 l,，,DMSO2,0 l,，,Taq DNA,聚合酶,(5 U,pJ)1,0 l,，,DNA,模板,(0,5 g,IL1)2,0 l,，擴(kuò)增第一外顯子時(shí)加引物,1 Ixl,；擴(kuò)增第二外顯子時(shí)加引物,0,3 l,，補(bǔ)所需,ddH2O,使反應(yīng)體系達(dá)到,50 I,。反應(yīng)條件：預(yù)變性,95,，,5min,，繼而,95,變性,50 s,，,65,退火,30 s,，,72,延伸,90 S,，共,35,個(gè)循環(huán)，最后,72,延伸,10 min,。第二輪，反應(yīng)體系,50 l,，擴(kuò)增第一和第二外顯子時(shí)加引物,1,25 l,。擴(kuò)增第一外顯子時(shí)另加,2 l DMSO(,擴(kuò)增第二外顯子時(shí)不加,DMSO),。反應(yīng)條件同第一輪。,擴(kuò)增,IB,第三到第六外顯子反應(yīng)體系,：,第一輪，,l0PCR,緩沖液,5,0 Ixl,，,MgCL,2,(25 mmol,L)4,0 l,，,dNTPs(10 mmol,L)2,0 l,，,Taq DNA,聚合酶,(5 U,L)1,0 l,，,DNA,模板,(0,5 g,L)2,0 l,，引物,1 l,。反應(yīng)條件同擴(kuò)增一、二外顯子者，但退火溫度為,63,。第二輪，反應(yīng)體系同第一輪，但擴(kuò)增引物為,1,25 L,。反應(yīng)條件為預(yù)變性,95,，,5 min,，繼而,95,變性,50 S,，,65,退火,30 S,，,72 oC,延伸,90 S,，共,35,個(gè)循環(huán)，最后,72,延伸,10 min,。）,憫籽哀鰓預(yù)笆旋炸滓我堆新萍綽羞色職靠養(yǎng)檬殷貍袒疆挽摻限爾馳揍指蹈霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),PCR,產(chǎn)物檢測(cè),取,5 l PCR,產(chǎn)物，用,2,瓊脂糖凝膠電泳分析，穩(wěn)流,120 mA,，,20 min,。,紫外燈下觀察。,IB,的,6,個(gè)外顯子陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為,exon1(476bp),、,exon2(433bp),、,exon3(399bp),、,exon4(184bp),、,exon5(381bp),和,exon6(441bp),。,吏螺熔害簿撕搐苫蛀取如驕扒勾臻覓童匡銹奴啤型罪謠走錫森賒瓢沙駿醇霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),預(yù)期結(jié)果,電泳,電泳條帶不在同一水平線上,基因明顯突變。,效批熟賂列侖則江撇父把仲膩晦怖托右術(shù)覺(jué)坎寡騙衰外嚴(yán)食瘍喚櫥柳彭琺霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),預(yù)期結(jié)果,電泳,電泳條帶在同一水平線上。,沒(méi)有突變,點(diǎn)突變或分子量很小的堿基序列突變,晰伺干限悉跋逐運(yùn)自兇擻勝孤猩巒嗜教懼玖悶獺漓鴦焦剝爭(zhēng)字藍(lán)晦娥閃肪霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),待測(cè)基因外含子測(cè)序,每管,DNA,樣品都要擴(kuò)增,2,次，使用上海博亞公司,ABI377DNA,測(cè)序儀對(duì),PCR,陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序。,舉緞貌崔成裔凋肥霸了配梨杯菱份蚊些練娠霧踴閻灣橙裸穴棗限非鋁推濾霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),預(yù)期結(jié)果,測(cè)序,堿基序列出現(xiàn)改變,圖,A-,箭頭處為,T-A,突變（,TGA,為終止密碼）,圖,B-,反向測(cè)序證實(shí),（藍(lán)色,-C,紅色,-T,，綠色,-A,，黑色,-G,）,氏鷹聾媳烏聘蔭翱保刮嗅力奸捕咳蠶信遠(yuǎn)靴淄贊冀芬峽拉間洱牲差瓦哉狹霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),預(yù)期結(jié)果,堿基序列沒(méi)有突變,C,、,D,分別為沒(méi)有突變的正、反向測(cè)序,僻廖臻慢辯漂慨雨揍懈戳金網(wǎng)罰伎橇寅濰醇寇士巳老趨怔時(shí)馱勾妥廷撬輸霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),預(yù)期結(jié)果,腫瘤細(xì)胞,I,B,基因突變率高，而反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞,I,B,基因沒(méi)有突變。,腫瘤細(xì)胞和反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞的,I,B,基因都沒(méi)有突變。,腫瘤細(xì)胞和反應(yīng)性增生的淋巴細(xì)胞的,I,B,的突變率都增加,IB,基因參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化有關(guān),IB,基因沒(méi)有參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化,估計(jì)不會(huì)發(fā)生這種情況，如若發(fā)生則需要進(jìn)一步研究,兜忌塊蒜靜頃樹(shù)糧焦趁嗜冉淘狙坡鋇墅撼釩瘧狐性炙蓬斷死窘叉叁田堪疊霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),參考文獻(xiàn),1 Bargou R.C,et al,.Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for proliferation and survival of Hodgkins disease tumor cells J.,J Clin Invest,1997,100(12):2961-9.,2 Dejardin E,et al,.Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells J.,Oncogene,1999,18(16):2567-77.,3 Emmerich F,et al,.Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutatio