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1、第二十章 免疫檢驗(yàn)自動(dòng)化儀器分析,免疫檢驗(yàn)自動(dòng)化 （automation of immunoassays) 是將免疫學(xué)反應(yīng)檢測(cè)過(guò)程中的取樣、加試劑、混合、溫育、固相載體分離、信號(hào)檢測(cè)、數(shù)據(jù)處理、打印報(bào)告和檢測(cè)后的儀器清洗等步驟由計(jì)算機(jī)控制，自動(dòng)化進(jìn)行。,第一節(jié) 自動(dòng)化免疫濁度分析系統(tǒng),免疫濁度分析的基本原理是：抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng)，形成小分子免疫復(fù)合物（19S），使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。在抗體稍微過(guò)量且固定的情況下，形成的免疫復(fù)合物量隨抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增大，即待測(cè)抗原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)。,一定波長(zhǎng)的入射光線通過(guò)抗原抗體反應(yīng)后的溶液時(shí)，被其中的免疫復(fù)合物微粒

2、吸收、反射和折射而減弱，在一定范圍內(nèi)，吸光度與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān)，而形成的免疫復(fù)合物量與參與反應(yīng)的抗原和抗體的量呈函數(shù)關(guān)系。與已知濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品比較，可確定標(biāo)本中抗原含量。,一、免疫透射比濁法,（一）原理：,1.將待檢標(biāo)本和抗原參考品作適當(dāng)稀釋。,（二）儀器工作過(guò)程,2.將待測(cè)標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液（5個(gè)濃度抗原標(biāo)準(zhǔn)品）與適當(dāng)過(guò)量的抗血清混合，在一定條件下，抗原抗體反應(yīng)完成后，在340nm處測(cè)定各管吸光度。,3.按log-logit轉(zhuǎn)換或y=ax3+bx2+cx+d方程進(jìn)行曲線擬合，制備劑量-反應(yīng)曲線，由計(jì)算機(jī)處理，計(jì)算出抗原濃度。,（三）方法評(píng)價(jià),優(yōu)點(diǎn): 靈敏度高，穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)

3、確,不足: 抗體用量較大； 溶液中存在的抗原抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大 透射比濁測(cè)定在抗原抗體反應(yīng)的第二階段，檢 測(cè)需在抗原抗體反應(yīng)達(dá)到平衡后進(jìn)行，耗時(shí)較長(zhǎng)。,用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒（一般為0.2 m），在遇到相應(yīng)抗原時(shí)，膠乳顆粒上的抗體與抗原特異結(jié)合，引起膠乳顆粒凝聚 ，使透射光和散射光即出現(xiàn)顯著變化。如圖所示：a為單個(gè)膠乳顆粒不阻礙光線透過(guò)，b為抗原抗體結(jié)合形成的凝聚膠乳大顆粒使透射光減弱或散射光增強(qiáng)。,二、免疫膠乳比濁法,（一）原理：,（二）方法評(píng)價(jià),本法敏感度大大高于普通比濁法，可達(dá)ng/L水平，操作簡(jiǎn)便，易自動(dòng)化；血清中的類風(fēng)濕因子(RF)可與IgG Fc段結(jié)合，使Ig

4、G致敏膠乳顆粒出現(xiàn)非特異性凝集，用F(ab)2片段代替IgG既可消除此干擾，又可克服IgG致敏膠乳的自凝現(xiàn)象；免疫膠乳輕度自凝或抗體活性降低會(huì)嚴(yán)重影響結(jié)果。,粒子對(duì)光線的散射作用是溶液中的微粒子受到光線照射后，微粒子對(duì)光線產(chǎn)生反射和折射而形成散射光。懸浮微粒對(duì)光散射形成的散射光強(qiáng)度與微粒的大小、數(shù)量、入射光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度、測(cè)量角度等因素密切相關(guān)，其公式如下：,三、免疫散射比濁法,(一) 原理,式I 中為與入射光成角處散射光強(qiáng)度；和I0為入射光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度；dn/dc為校正因子，反映了溶液折射指數(shù)和顆粒濃度的變化；M為顆粒分子量；c為濃度；N為阿佛加德指數(shù)；為顆粒到檢測(cè)器的距離；為散射光與入射光的

5、夾角（散射夾角）。,II042（dn/dc) 2 Mc(1+cos) N24,定時(shí)散射比濁法是在保證抗體過(guò)量的情況下，加入待測(cè)抗原，此時(shí)反應(yīng)立即開(kāi)始，在反應(yīng)的第一階段，溶液中產(chǎn)生的散射光信號(hào)波動(dòng)較大，所獲取的信號(hào)計(jì)算出的結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定的誤差。定時(shí)散射比濁法是避開(kāi)抗原抗體反應(yīng)的不穩(wěn)定階段，即散射光信號(hào)在開(kāi)始反應(yīng)7.5s2min內(nèi)的第一次讀數(shù)，專門在抗原抗體反應(yīng)的最佳時(shí)段進(jìn)行讀數(shù)，將檢測(cè)誤差降到最低。,(二)定時(shí)散射比濁法（fixed time nephelometry）,定時(shí)散射比濁法測(cè)定原理示意圖,1. 儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn),(1) 抗原抗體預(yù)反應(yīng)階段 (2) 反應(yīng)階段(3) 信號(hào)檢測(cè),2. 抗原

6、過(guò)量檢測(cè),(1) 抗體適當(dāng)過(guò)量 (2) 對(duì)抗原過(guò)量進(jìn)行閾值限定,BN ProSpec全自動(dòng)特定蛋白分析儀,速率散射比濁法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)測(cè)定法。所謂速率是指抗原抗體反應(yīng)在單位時(shí)間內(nèi)形成免疫復(fù)合物的量（不是免疫復(fù)合物累積的量），連續(xù)測(cè)定各時(shí)間復(fù)合物形成的速率與其產(chǎn)生的散射光信號(hào)聯(lián)系在一起，形成動(dòng)態(tài)的速率散射比濁法，每項(xiàng)檢測(cè)僅12min即可完成。,(三)速率散射比濁法（rate nephelometry）,儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn),開(kāi)啟機(jī)器，進(jìn)行定標(biāo) 反應(yīng)階段 抗原過(guò)量檢測(cè),抗原抗體復(fù)合物形成的速率,抗原抗體反應(yīng)速率的動(dòng)態(tài)變化,IMMAGE全自動(dòng)特定蛋白分析儀,(三)方法評(píng)價(jià),散射比濁法是目前臨

7、床應(yīng)用較多的一種方法，本法自動(dòng)化程度高，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、精密等優(yōu)點(diǎn)。采用抗原過(guò)量檢測(cè)方法，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。但儀器和試劑價(jià)格比較貴, 對(duì)抗體的質(zhì)量要求很高。,1.抗原抗體比例 2.抗體的質(zhì)量 3.增濁劑的使用,（一）免疫比濁分析的影響因素,四、免疫比濁分析的影響因素和臨床應(yīng)用,4.偽濁度 5.入射光光源和波長(zhǎng) 6.結(jié)果報(bào)告中的計(jì)量單位 7.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備與質(zhì)量控制,（二）臨床應(yīng)用,免疫比濁分析法主要用于檢測(cè)免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、鏈、鏈、免疫球蛋白亞類；補(bǔ)體C3、C4；血漿蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、1-抗胰蛋白酶(1-AT)、2-微球蛋白(2-MG)、轉(zhuǎn)鐵蛋白

8、(TRF)、銅藍(lán)蛋白(CER)、結(jié)合珠蛋白(HP)、，C-反應(yīng)蛋白(CRP)、載脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、類風(fēng)濕因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治療性藥物濃度等。,第二節(jié)自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng),自動(dòng)化發(fā)光免疫分析儀主要由樣本盤、試劑盤(盒)、溫育反應(yīng)系統(tǒng)、固相載體分離清洗系統(tǒng)、信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理、控制系統(tǒng)組成。,吖啶酯標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀是一種用發(fā)光劑直接標(biāo)記抗體或抗原的一類免疫分析法。該儀器利用化學(xué)發(fā)光技術(shù)和磁性微粒子分離技術(shù)，以吖啶酯為化學(xué)發(fā)光劑，以細(xì)小的順磁性微粒為固相載體。其測(cè)定原理與雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合法等相同。,一、吖啶酯標(biāo)記化學(xué)發(fā)

9、光免疫分析儀,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,順磁性微粒示意圖,磁微粒技術(shù),磁微粒在電磁場(chǎng)中分離,磁微粒標(biāo)記抗體,發(fā)光,Y,Y,Y,磁微粒,被測(cè)抗原,+,抗體,+,帶丫啶酯標(biāo)記物抗體,沖洗后,雙抗體夾心法,直接化學(xué)發(fā)光的機(jī)理,（1）加入酸性H2O2（pH10）,儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn),抗原抗體結(jié)合 洗滌、分離 加入氧化劑發(fā)光 信號(hào)檢測(cè),吖啶酯標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定示意圖,ACS：180 SE和ACSCENTAUR化學(xué)發(fā)光免疫分析儀,ACS：180 SE,ACSCENTAUR,ci8200,i2000sr,酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光或熒光反應(yīng)的酶來(lái)標(biāo)記抗原或抗體，在抗原抗

10、體反應(yīng)后，加入底物(發(fā)光劑)，由酶催化和分解底物發(fā)光，通過(guò)光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)進(jìn)行被測(cè)物的定量。 常用的標(biāo)記酶有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶(ALP)，常用的發(fā)光底物有魯米諾、AMPPD和4-MUP等。,二、酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀,該儀器采用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗原或抗體、以塑料錐形小管為固相載體，魯米諾為化學(xué)發(fā)光劑，還利用增強(qiáng)劑使化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增加、時(shí)間延長(zhǎng)。,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀,魯米諾是一種還原劑，在堿性溶液中被H2O2氧化產(chǎn)生魯米諾衍生物（激發(fā)態(tài)）。它以光量子輻射形式返回基態(tài)時(shí)，發(fā)出微綠色可見(jiàn)光。,魯米諾增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光的原理,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定示意

11、圖,Vitros ECi全自動(dòng)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光酶免分析儀, 堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀,該儀器是以堿性磷酸酶標(biāo)記抗原或抗體，以順磁性微粒子為固相載體，用AMPPD作為化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行測(cè)定的自動(dòng)化儀器。,AMPPD發(fā)光反應(yīng)原理示意圖,抗原抗體結(jié)合 洗滌、分離 加入AMPPD發(fā)光劑 信號(hào)檢測(cè),儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn),堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定示意圖,Access全自動(dòng)酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀,UniCelDxI 800,IMMULITE 2000型全自動(dòng)酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng),（三）堿性磷酸酶標(biāo)記的微粒子熒光免疫分析儀,該儀器以堿性磷酸酶標(biāo)記抗原或抗體，以塑料微粒為固相載體包被抗體（或抗原）

12、，以4-甲基傘型酮磷酸鹽（4-MUP）作為酶促反應(yīng)的熒光基質(zhì)（底物），底物被酶水解后，脫磷酸根基團(tuán)，形成4-甲基傘型酮(4-MU)，用360nm激發(fā)光照射，發(fā)出450nm的熒光。,4-甲基傘型酮磷酸鹽（4-MUP）反應(yīng)原理示意圖,儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn),抗原抗體結(jié)合 洗滌、分離 加入底物4-MUP 信號(hào)檢測(cè),堿性磷酸酶標(biāo)記的微粒子熒光免疫測(cè)定示意圖,AXSYM全自動(dòng)酶標(biāo)記熒光免疫分析儀,AIA-1800型全自動(dòng)酶標(biāo)記熒光免疫分析儀,電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過(guò)程。電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀是采用電化學(xué)發(fā)光技術(shù)，生物素放大技術(shù)

13、，以順磁性微粒為固相載體，用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗原或抗體，三丙胺(TPA)為電子供體，而設(shè)計(jì)的一種自動(dòng)化分析儀器。電化學(xué)發(fā)光穩(wěn)定、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，易于控制并可根據(jù)待測(cè)分子的大小設(shè)計(jì)成多種反應(yīng)模式如夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法等。,三、 電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀,電化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光的反應(yīng)原理,三聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)3 2+分子結(jié)構(gòu)圖,時(shí)間分辨熒光免疫分析儀是用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體作為示蹤物，與時(shí)間分辨測(cè)定技術(shù)結(jié)合而制造出來(lái)的一種自動(dòng)化分析儀。熒光偏振免疫測(cè)定是一種均相熒光免疫測(cè)定法，常采用抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)原理，適用于小分子半抗原（如藥物濃度）的檢測(cè)。全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀是由多個(gè)模塊組成，用一臺(tái)計(jì)算機(jī)、一套操作系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了

14、從標(biāo)本稀釋、加樣到酶標(biāo)板孵育、洗滌、加試劑、再孵育、洗滌、酶標(biāo)板讀數(shù)和結(jié)果打印自動(dòng)化。其結(jié)果是減輕了勞動(dòng)強(qiáng)度，縮短了試驗(yàn)時(shí)間，提高了工作效率，為全面實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化打下了基礎(chǔ)。,磁性微粒直徑2.8m，表面的凸凹使包被面積放大。磁性微粒體積小，懸浮于反應(yīng)體系中，形成均一穩(wěn)定的液相，在磁場(chǎng)中易于分離。,儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn),抗原抗體結(jié)合 電化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 光信號(hào)檢測(cè) 檢測(cè)完畢,電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定示意圖,電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定工作示意圖,AMPPD特性,堿性PH環(huán)境下，非酶解性的水解很低熱穩(wěn)定性好PH9時(shí)酶解速度最快，PH9.5時(shí)信噪比最低發(fā)光為持續(xù)型，15min達(dá)到高峰，60min內(nèi)強(qiáng)度維持不變,相對(duì)發(fā)光單

15、位,00 5 10 55 60,時(shí)間（分鐘）,發(fā)光圖譜連續(xù)，穩(wěn)定。 允許多次記數(shù)，取均值作為結(jié)果。,AMPPD發(fā)光圖譜,ACCESS分析簡(jiǎn)要流程,ACCESS,專利，獨(dú)有技術(shù)磁性微粒子技術(shù)：d7 超聲波清洗系統(tǒng)：交叉污染率300臺(tái) 150臺(tái)開(kāi)展項(xiàng)目 42 25 38連續(xù)檢測(cè)數(shù) 600 260 300消耗品隨機(jī)更換 可 不可 不可試劑穩(wěn)定性 1年 3個(gè)月 1年試劑定貨周期 1周 1月以上 3月以上試劑上機(jī)保存時(shí)間 到效期 8H 4周性能價(jià)格比 高 低 中,高特異經(jīng)典免疫學(xué)原理，單克隆抗體技術(shù)大分子采用夾心法分析小分子采用競(jìng)爭(zhēng)法分析專利的磁性分離技術(shù),ACCESS 系統(tǒng)特點(diǎn),高靈敏采用最靈敏、最穩(wěn)

16、定的ALP-Dioxetane放大系統(tǒng)采用最持久最穩(wěn)定的發(fā)光劑AMPPD 采用磁性微粒子技術(shù)(d7) 擴(kuò)大包被面積以TSH為例， 檢測(cè)限達(dá)0.003IU/ml，為第三代TSH,ACCESS 系統(tǒng)特點(diǎn),高穩(wěn)定發(fā)光信號(hào)穩(wěn)定，持續(xù)高質(zhì)量原廠試劑, 無(wú)需預(yù)處理穩(wěn)定，持久的標(biāo)準(zhǔn)曲線，有效期長(zhǎng)達(dá)28天以上機(jī)上試劑冷藏系統(tǒng)，試劑3度保存，有效期長(zhǎng)多層覆膜試劑盒，確保試劑穩(wěn)定,ACCESS 系統(tǒng)特點(diǎn),高準(zhǔn)確超靈敏光電倍增管檢測(cè)發(fā)光信號(hào)發(fā)光穩(wěn)定后，記錄10次/s，取均值為結(jié)果超聲波清洗系統(tǒng)，嚴(yán)格防止交叉污染(1ppm)系統(tǒng)自動(dòng)QC管理 (Levy-Jennings),ACCESS 系統(tǒng)特點(diǎn),ACCESS 系統(tǒng)特

17、點(diǎn),全自動(dòng)，連續(xù)，任選，隨機(jī)式檢測(cè)速度100測(cè)試/小時(shí)，第一個(gè)結(jié)果需15分鐘利用條碼連續(xù)加入標(biāo)本，一次上機(jī)60個(gè)，運(yùn)行中 利用條碼連續(xù)加入試劑，一次上機(jī)24個(gè)，運(yùn)行中不停機(jī)加入各種耗品，耗品預(yù)警功能24小時(shí)待機(jī)，確保急診檢測(cè) HCG; Myoglobin; Troponin計(jì)算機(jī)控制，形象化軟件，Host Query功能,ACCESS 試劑項(xiàng)目,心血管動(dòng)力學(xué) Accu TnI糖尿病甲狀腺激素 第三代TSH血液病毒 內(nèi)分泌系統(tǒng) 性激素感染性疾病貧血腫瘤因子 游離PSA過(guò)敏原代謝疾病治療藥物監(jiān)測(cè),可用于內(nèi)分泌激素類、腫瘤標(biāo)志物類、心肌標(biāo)志物類、病毒標(biāo)志物類、治療性藥物濃度、骨代謝指標(biāo)和貧血類等方面

18、的檢測(cè)，是目前免疫化學(xué)應(yīng)用最為廣泛的新技術(shù)。,四、在臨床免疫檢測(cè)中的應(yīng)用,第三節(jié) 自動(dòng)化熒光免疫分析系統(tǒng),熒光免疫自動(dòng)化分析主要是將抗原抗體結(jié)合反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析和計(jì)算機(jī)技術(shù)有機(jī)結(jié)合的一項(xiàng)自動(dòng)化免疫分析技術(shù)。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需要進(jìn)行固相分離，分為均相和非均相兩類。非均相熒光免疫測(cè)定主要有時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定法；均相熒光免疫測(cè)定主要有熒光偏振免疫測(cè)定法。,時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（time resolved fluorescence immunoassay, TRFIA）是以鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體作為示蹤物，并與時(shí)間分辨測(cè)定技術(shù)相結(jié)合，建立起來(lái)的一種新型非放射性微量分析技術(shù)，具有靈敏度高，

19、鑭系元素發(fā)光穩(wěn)定，熒光壽命長(zhǎng)，不受樣品自然熒光干擾，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬等特點(diǎn)，已在臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛使用。,一、時(shí)間分辨熒光免疫分析儀,Eu3+元素激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間的stokes位移,（一）、原理,時(shí)間分辨Eu3+元素?zé)晒庑盘?hào)測(cè)量示意圖,（二）儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn), 抗原抗體結(jié)合 加入Eu3+螯合抗體 加入酸性增強(qiáng)液 4. 信號(hào)檢測(cè),固相雙抗體夾心TRFIA檢測(cè)過(guò)程示意圖,增強(qiáng)液(enhancement solution)，使Eu3+抗體抗原復(fù)合物的PH值降低至23，以利于Eu3+從復(fù)合物上完全解離下來(lái)，游離的Eu3+為增強(qiáng)液中的另一種螯合劑所螯合，在協(xié)同劑等其它成分的作用下，與增強(qiáng)液中的-二酮體生

20、成一個(gè)Eu3+在其內(nèi)部的保護(hù)性膠態(tài)分子團(tuán)，這是一個(gè)新的具有高強(qiáng)度熒光的穩(wěn)定螯合物，它在紫外光的激發(fā)下發(fā)射很強(qiáng)的熒光，信號(hào)的增強(qiáng)效果可達(dá)上萬(wàn)倍，該技術(shù)使用了解離增強(qiáng)步驟，并且采用了前后兩種不同的螯合劑，前一種用于Eu3+與抗體標(biāo)記，后一種用于與解離下來(lái)的Eu3+螯合成新的強(qiáng)熒光發(fā)射分子，因此，又將該技術(shù)稱為解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖?dissociation-enhanced lanthanide fluoroimmunoassay, DELFIA),（三）解離增強(qiáng)原理：,auto DELFIA全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)系統(tǒng),1. TRFIA分析用的酸性增強(qiáng)液易受環(huán)境、試劑、容器等里面的鑭系元素污

21、染，使本底升高，所用試劑和器材應(yīng)盡量防塵。 2.TRFIA分析用載體最常用的是聚苯乙烯微96孔板，其熒光本底低，并有洗滌微孔板的自動(dòng)裝置，但不同廠家生產(chǎn)的微孔板，所產(chǎn)生的熒光有很大差異，應(yīng)選擇應(yīng)用。,（四）注意事項(xiàng),熒光偏振免疫測(cè)定(fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA)，為一種均相熒光免疫測(cè)定方法，其利用熒光物質(zhì)在溶液中被單一平面的偏振光照射后，可吸收光能而產(chǎn)生另一單一平面的偏振發(fā)射熒光，該熒光強(qiáng)度與熒光 標(biāo)記物質(zhì)在溶液中旋轉(zhuǎn)的速度與分子大小呈反比，常采用抗原-抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)原理，適用于小分子半抗原（如藥物濃度）的檢測(cè)。,二、熒光偏振免疫分析儀,

22、光的本質(zhì)是電滋波，光是各個(gè)方向電滋波的混合物，當(dāng)光線通過(guò)偏振濾光片后，形成只有一個(gè)方向的電滋波，稱之為偏振光。熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的偏振光（藍(lán)色光，485nm）激發(fā)后，可吸收光能躍入激發(fā)態(tài)，在其恢復(fù)至基態(tài)時(shí)，釋放能量并發(fā)射出單一平面的偏振熒光（綠色光，525nm550nm） 。偏振熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)分子在液相中轉(zhuǎn)動(dòng)的速度呈反比，即分子大轉(zhuǎn)動(dòng)速度慢，熒光強(qiáng)度大，分子小轉(zhuǎn)動(dòng)速度快，熒光強(qiáng)度小。,(一) 原理,偏振光和偏振熒光發(fā)生示意圖,熒光偏振免疫測(cè)定工作原理示意圖,1. 抗原抗體反應(yīng) 2.偏振熒光強(qiáng)度測(cè)定,（二） 儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn),1.FPIA的結(jié)果好壞取決于熒光素標(biāo)記的好壞、激發(fā)態(tài)熒光的平均壽命

23、、抗原的相對(duì)分子量和復(fù)合物的特性等因素。2.為提高FPIA靈敏度，可用除蛋白劑對(duì)標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，除去干擾成分。,（三）注意事項(xiàng),第四節(jié) 自動(dòng)化酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng),根據(jù)全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)的處理模式，人們通常將全自動(dòng)酶免分析儀分成二類，一類為分體機(jī)，一類為連體機(jī)。分體機(jī)是由“前處理系統(tǒng)”即全自動(dòng)樣本處理工作站和“后處理系統(tǒng)”即全自動(dòng)酶免分析儀兩個(gè)獨(dú)立的部分組成。連體機(jī)是由多個(gè)模塊組成，使用一臺(tái)計(jì)算機(jī)、一套操作系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了從標(biāo)本稀釋、加樣到酶標(biāo)板孵育、洗滌、加試劑、再孵育、洗滌、讀數(shù)和結(jié)果打印全自動(dòng)進(jìn)行。,（一）儀器組成和性能,1.條形碼識(shí)別系統(tǒng) 2.樣本架和加樣系統(tǒng) 3.試劑架 4.溫育系統(tǒng),5.

24、液路系統(tǒng) 6.洗板系統(tǒng) 7. 酶標(biāo)板讀數(shù)儀 8.自動(dòng)裝載傳遞系統(tǒng) 9. 計(jì)算機(jī)管理和信息系統(tǒng),全自動(dòng)酶免分析儀中的連體機(jī)是將樣本處理工作站和全自動(dòng)酶免分析儀聯(lián)合起來(lái)，工作速度快，自動(dòng)化程度高，適合大批量樣本的處理，如血站系統(tǒng)。分體機(jī)，由于它有一個(gè)獨(dú)立的全自動(dòng)樣本處理站，加樣速度快，適合試驗(yàn)項(xiàng)目變化多、樣本批量不等的臨床實(shí)驗(yàn)室。,（二）儀器評(píng)價(jià),采用流水線式操作,加樣,洗板,常用英語(yǔ)單詞,Reagent :試劑Sample：標(biāo)本Calibration：校準(zhǔn)，定標(biāo)Maintenance：維修，保養(yǎng)Alarm:報(bào)警Rack：試管架,1. 什么是免疫檢驗(yàn)自動(dòng)化？應(yīng)用哪些技術(shù)？?jī)?yōu)點(diǎn)是什么？2. 免疫濁度

25、分析的原理是什么？有哪些臨床應(yīng)用？3. 免疫膠乳比濁法和免疫散射比濁法的原理是什么？4. 定時(shí)散射比濁法和速率散射比濁法的測(cè)定原理，其抗原過(guò)量檢測(cè)有什么不同點(diǎn)？5. 免疫比濁分析的影響因素有哪些？6. 吖啶酯標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀技術(shù)要點(diǎn)是什么？7. 酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀的原理，有哪幾種類型？各有什么特點(diǎn)？8. 電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定的技術(shù)要點(diǎn)是什么？9. 時(shí)間分辨熒光免疫分析儀測(cè)定的技術(shù)要點(diǎn)是什么？注意事項(xiàng)有哪些？10. 全自動(dòng)酶免分析儀的組成成分有哪些？?jī)?yōu)點(diǎn)是什么？,思考題,免疫檢驗(yàn)自動(dòng)化是將免疫檢驗(yàn)過(guò)程中的取樣、加試劑、混合、溫育、固相載體分離、信號(hào)檢測(cè)、數(shù)據(jù)處理、打印報(bào)告和儀器清洗等步驟由計(jì)算機(jī)控制，儀器自動(dòng)化進(jìn)行。定時(shí)散射比濁法是在保證抗體過(guò)量的情況下，加入待測(cè)抗原，在抗原抗體反應(yīng)的第一階段，溶液中產(chǎn)生的散射光信號(hào)波動(dòng)大，所獲取的信號(hào)不穩(wěn)定，定時(shí)散射比濁法避開(kāi)這一階段，專門測(cè)定抗原抗體反應(yīng)的最佳時(shí)段，使檢測(cè)誤差降到最低。,小結(jié),吖啶酯標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀是一種用發(fā)光劑直接標(biāo)記抗體或抗原，以磁性微粒為固相載體的一種免疫分析法，吖啶酯發(fā)光只需加入氧化劑和pH糾正液，不需要酶催化。酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光或熒光反應(yīng)的酶來(lái)標(biāo)記抗原或抗體，在抗原抗體反應(yīng)后，加入底物(發(fā)光劑)，由酶催化和分解底物發(fā)光，通過(guò)光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)進(jìn)行定量。,