《異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌Pseudomonas sihuiensis YG5脫氮性能及影響因素 生物技術專業(yè)》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌Pseudomonas sihuiensis YG5脫氮性能及影響因素 生物技術專業(yè)（35頁珍藏版）》請在裝配圖網上搜索。

1、異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌Pseudomonas sihuiensis YG5 脫氮性能及影響因素 【摘要】研究目的：對污水處理廠中的污泥進行處理，從其中將一部分脫氮能力比較強的異氧硝化-好氧反硝化菌篩出來，然后要研究這部分菌類，分析其脫氮能力以及影響脫氮能力強弱的影響因素。研究方法，選擇龍津污水處理廠作為取材地點，從中采集污泥，然后在污泥中將一部分脫氮能力比較強的異氧硝化-好氧反硝化菌篩選出一株，接下來在各個角度對其屬于何種、何屬生物進行判別，包括形態(tài)學角度、分子學角度等等，分析其異養(yǎng)硝化與好氧反硝化脫氮性能，并采用單因素與響應面結合的方法研究其影響因素。結果表明：富集分離純化篩選的

2、菌株編號為YG5，經鑒定為西徽假單胞菌（Pseudomonas sihuiensis.）。YG5異養(yǎng)硝化脫氮影響因素結果表明：每升中的檸檬酸鈉含量為12.26克，硫酸銨0.47克，pH=8.07，31.67攝氏度，C/N=30，250.00 mL三角瓶裝量為82.61 mL，YG5經培養(yǎng)24h，其對NH4+-N去除率達到99.00%，幾乎無NO3--N及NO2--N的積累，且該菌株耐受最大NH4+-N濃度可達2000 mg·L-1。在好氧反硝化過程中，YG5耐受最大NO3--N濃度為800 mg·L-1；在好氧亞硝化過程中，YG5耐受的最大NO2--N濃度為300 mg·L-1。YG5好氧反硝

3、化和好氧亞硝化脫氮性能的最佳C/N均為30，且可耐受C/N范圍均為15~80，說明YG5能耐受高濃度有機物，具有處理高濃度有機含氮廢水的潛能。Pseudomonas sihuiensis YG5氮平衡結果表明：當初始NH4+-N濃度為99.12 mg·L-1時，在好氧反硝化過程中轉化為氣態(tài)氮為44.13±2.12%，同化為細胞的氮44.73±0.83%；若是初始的NO3--N每升含量為99.29毫克的話，則在整個反應進行的時候會有16.44±0.41%轉化為氣態(tài)氮，同化為細胞的氮為63.23±0.93%。 【關鍵詞】異養(yǎng)硝化；好氧反硝化；假單胞菌；脫氮；耐高濃度有機物；氮平衡 目錄

4、1. 引言 1 2. 材料與方法 1 2.1菌株來源 1 2.2實驗培養(yǎng)基 1 2.3實驗儀器 2 2.4菌株的鑒定 2 2.4.1形態(tài)學鑒定 2 2.4.2生理生化鑒定 2 2.4.2分子生物學鑒定 2 2.5水質測定方法 3 2.6 YG5脫氮性能研究 4 2.6.1種子液的制備 4 2.6.2異養(yǎng)硝化性能 4 2.6.3好氧反硝化性能 4 2.6.4好氧亞硝化性能 4 2.7異養(yǎng)硝化脫氮性能影響因素 4 2.7.1碳源對YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 4 2.7.2 C/N對YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 4 2.7.3培養(yǎng)條件對YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 4 2

5、.7.4 NH4+-N濃度對YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 5 2.8好氧反硝化脫氮性能影響因素 5 2.8.1 C/N對YG5好氧反硝化性能的影響 5 2.8.2 NO3--N濃度對YG5好氧反硝化性能的影響 5 2.8.3 C/N對YG5好氧亞硝化性能的影響 5 2.8.4 NO2--N濃度對YG5好氧亞硝化性能的影響 5 2.9氮平衡分析 5 3. 實驗結果與分析 6 3.1菌種的鑒定 6 3.1.1形態(tài)學鑒定 6 3.1.2生理生化鑒定 6 3.1.3 分子生物學鑒定 7 3.2菌種YG5脫氮性能結果 8 3.2.1異養(yǎng)硝化性能結果 8 3.2.2好氧反硝化性能結

6、果 9 3.2.3好氧亞硝化性能結果 10 3.3異養(yǎng)硝化脫氮性能影響因素 11 3.3.1碳源對YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 11 3.3.2 C/N對YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 12 3.3.3培養(yǎng)條件對YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 13 3.3.4 NH4+-N濃度對YG5異養(yǎng)硝化性能的影響結果 16 3.4好氧反硝化脫氮性能影響因素 17 3.4.1 C/N對YG5好氧反硝化性能的影響結果 17 3.4.2 NO3--N濃度對YG5好氧反硝化性能的影響結果 18 3.4.3 C/N對YG5好氧亞硝化性能的影響結果 19 3.4.4 NO2--N濃度對YG5好氧亞硝化性能的影

7、響 20 3.5氮平衡結果分析 23 4.結論 24 致謝 25 參考文獻 25 1. 引言 隨著經濟的快速發(fā)展，人們對自然環(huán)境的過度開發(fā)以及工農業(yè)的快速發(fā)展，隨之帶來的是河流或者湖泊等之中的水被各種有害元素污染，在這些污染元素中，氮是含量最多，帶來的污染也最大的幾種污染元素之一，其所存在的形式有多種，比方說有機氮、亞硝酸氮等等[1]。其中氨氮對人類造成的危害主要有各種血液疾病，比方說高血壓；而硝酸鹽若是隨著人類的飲用而進入人體中，則會發(fā)生反應轉化成亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽會給人類帶來極高的致癌風險[2,3]。因此，解決水體中氮素污染問題以及氮素處理必定能夠減少人類的病痛，提高幸福

8、指標。 目前，我國污水脫氮處理技術主要包括物理化學法和生物法[4]。物理化學法一般只能去除水中特定形態(tài)的氮，其反應簡單易控制，基建投資小，但是工藝復雜，成本高，對環(huán)境易產生二次污染，且吸附與過濾材料再生困難，適合規(guī)模較小的污水處理廠[2]。生物脫氮以其安全，高效，經濟，可持續(xù)等特點被認為是去除水體中氮元素最具有發(fā)展前景的方法[3]。以傳統(tǒng)的脫氮技術來進行脫氮的話，通常要經歷兩個步驟，第一步是硝化，第二步是反硝化，因為這兩個步驟中中微生物生長緩慢，且因過程所需條件的不同導致硝化作用和反硝化作用不能同時在同一反應器中進行，在實際污水處理過程中的脫氮效率低，大大增加了污水處理過程的難度[5]。

9、隨著國內外技術的不斷進步，生物脫氮技術發(fā)生了質的提高，出現(xiàn)了各種不同的新技術，有短程硝化技術、同步硝化技術等等[6]。其中，反硝化技術以及同步硝化技術具備一些吸引人的優(yōu)點，比方說反應容器小、反應系統(tǒng)pH穩(wěn)定、系統(tǒng)反應時間短、投資和運行成本低等，因為這些優(yōu)點而受到了業(yè)界人士的好評，迅速成為一個人們的研究方向。目前已知的擁有異養(yǎng)硝化—好氧反硝化功能的菌屬有假單胞、不動桿、芽孢桿、節(jié)桿、卓貝爾氏、產堿桿、弧菌等不同種類及性質的菌屬[8,9,10,11]。 雖然異養(yǎng)硝化—好氧反硝化菌的研究很多，其在污水治理領域扮演越來越重要的角色，但仍面臨著一些問題，例如異養(yǎng)硝化—好氧反硝化菌適應的氮濃度范圍較窄、

10、耐受的氮素負荷較低、低C/N比條件下脫氮性能較差等問題 [12,13]。因此，仍有必要進行異養(yǎng)硝化—好氧反硝化菌的篩選，尋找在實際應用中適應性能更強的優(yōu)勢脫氮菌株。 這里計劃在篩選出需要的菌以后，在各個角度對其屬種進行判別，包括形態(tài)學角度、分子學角度等等，分析其異養(yǎng)硝化與好氧反硝化性能以及對其性能造成影響的各種影響因素（碳源、C/N、pH、溫度、裝量、耐受氮濃度等）進行探究，希望能夠能夠將生物脫氮理論或者菌種資源進行完善，同時給如何在實際的污水處理工作中處理這種菌種提供借鑒。 2. 材料與方法 2.1菌株來源 以福建省龍巖市龍津污水廠采集的活性污泥為菌株來源。通過富集、分離純化、初篩和

11、復篩，選取具有異養(yǎng)硝化好氧反硝化性能的YG5為目的菌株。YG5采用了斜面保藏和低溫冷凍保藏法保存菌種[14]。短期內工作用菌種保藏在4℃牛肉膏蛋白胨斜面，長期使用-80℃甘油懸液低溫冷凍保藏。 2.2實驗培養(yǎng)基 （1）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏 3，NaCl 10，蛋白胨10，pH 7.0-7.2。 （2）LB液體培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸膏 5，NaCl 10，蛋白胨 10，pH 7.0。 （3）DM富集培養(yǎng)基(g/L)：Na2HPO4·7H2O 7.9，KH2PO4 1.5，NH4Cl 0.3，MgSO4·7H2O 0.1，(CH2COONa)2·6H2O 4.7，KNO3

12、 0.3，微量元素溶液 2 mL·L-1。 （4）DM初篩培養(yǎng)基 (g/L)：Na2HPO4·7H2O 7.9，KH2PO4 1.5，MgSO4·7H2O 0.1，(CH2COONa)2·6H2O 4.7，KNO3 0.3，微量元素溶液 2 mL·L-1 。 微量元素溶液(g·L-1)：ZnSO4 2.2，CaCl 5.5，MnCl2·4H2O 5.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0， （NH4)6Mo7O24·4H2O 1.1，CuSO4·5H2O 1.6，CoCI2·6H2O 1.6，EDTA 50，pH 7.0。 （5）異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基(g·L-1)：（NH4)2SO4 0.47，（

13、CH2C00Na)2 ·6H2O 4.5（或 C6H5Na3O7·2H2O 3.27），維氏鹽溶液50 mL·L-1，pH 7.0。 （6）好氧反硝化培養(yǎng)基(g·L-1)：KNO3 0.72，（CH2C00Na)2·6H2O 4.5（或C6H5Na3O7·2H2O 3.27）， 維氏鹽溶液50 mL·L-1，pH 7.0。 （7） 好氧亞硝化培養(yǎng)基(g·L-1)：NaNO2 0.49，（CH2C00Na)2 ·6H2O 4.5（或C6H5Na3O7·2H2O 3.27）， 維氏鹽溶液 50 mL/L，pH 7.0。 維氏鹽溶液(g/L)：K2HPO4 6.54，MgSO4·7H2O

14、 2.5，NaCl 2.5，MnSO4·H2O 0.04，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05。 （注：在這些培養(yǎng)基中夾雜一定的瓊脂，以1.5~2%為宜，之后制成固體培養(yǎng)基，再將其經過高溫滅菌處理，121℃高溫下處理二十分鐘即可。） 2.3實驗儀器 在實驗過程中需要用到的一些器材在下表1中羅列出來： 表1 儀器設備表 Table 1 Equipment table 編號 設備名稱 型號 生產廠家 1 立式自動高壓滅菌鍋 HVE-50 廈門柏嘉生物科技有限公司 2 電熱恒溫鼓風干燥箱 DGG-9240B型 上海森信實驗儀器有限公司 3 生化培養(yǎng)箱 SHP-

15、250型 上海森信實驗儀器有限公司 4 隔水式恒溫培養(yǎng)箱 GRP-9160型 上海森信實驗儀器有限公司 5 空氣培養(yǎng)搖床 SPH-100B SHIPING OSCILLATOR 6 Sartorius電子天平 BSA224S-CW 賽多利斯 7 梯度PCR儀 MULTISKAN-GO 賽默飛世爾科技（中國）有限公司 8 大容量高速冷凍離心機 ST16R 賽默飛世爾科技（中國）有限公司 9 臺式高速冷凍離心機 LEGEND MICRO17R 賽默飛世爾科技（中國）有限公司 10 超微量分光光度計 MULTISKAN-GO 賽默飛世爾科技（

16、中國）有限公司 11 雙目顯微鏡 BA210 麥克奧迪實業(yè)集團有限公司 12 紫外分光光度計 UV-1800 上海美譜達儀器有限公司 13 水浴鍋 XMTE-8112 精宏 14 超凈工作臺 SW-CJ-1F 蘇州安泰空氣技術有限公司 15 多參數(shù)水質分析儀 連化科技 2.4菌株的鑒定 2.4.1形態(tài)學鑒定 將經過篩選后所獲得的菌株放在牛肉膏蛋白胨平板，經過二十四小時的培養(yǎng)以后對其進行觀察，觀察內容包括菌落形態(tài)，革蘭氏染色等以及經過透射電鏡觀察的菌體形態(tài)。 2.4.2生理生化鑒定 在進行生理生化試驗的時候參考相關手冊來進行[15][15]

17、 2.4.2分子生物學鑒定 首先要將細菌的DNA提出出來，這里用來提取的工具是Ezup柱式細菌基因組DNA提取試劑盒，在提取的時候嚴格按照標準來進行，提取出來的DNA用細菌的通用引物擴增。下表2為PCR引物和它的序列，表3表示的是反應體系，表4表示的反應條件[17,18]。對PCR產物實施檢測所使用的原料是1%瓊脂糖凝膠，在處于220V的電壓下進行半個小時的電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像拍照，確定擴增條帶后送至蘇州金唯智公司進行序列的測定。 表2 PCR擴增引物 Table 2 PCR amplification primers 基因 引物 序列 （5'-3'） 片段長度

18、 （bp） 16S rRNA 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1500 1492R GGTTACCTTGTTACGACTT napA NAP1 TCTGGACCATGG-GCTTCAACCA 877 NAP2 ACGACGACCGGCCAGCGCAG 表3 PCR反應體系 Table 3 PCR reaction system 反應體系 體積（μL） 10×PCR buffer 2.5 dNTP 0.5 F 0.5 R 0.5 Taq酶 0.25 ddH2O 20.75 Total 25 表4 16S

19、 rRNA、napA基因的PCR反應程序 Table 4 PCR reaction procedures for 16S rRNA，napA genes 基因 PCR反應程序 16S rRNA napA基因 預變性 95℃/3 min 94℃/5 min 變性 95℃/45s 94℃/30s 退火 55℃/45s 58℃/30s 延伸 72℃/45s 72℃/1 min 循環(huán)數(shù) 35 30 補充延伸 72℃/7 min 72℃/7 min 2.5水質測定方法 若是用常規(guī)方法來進行分析的話，可以選擇的指

20、標有很多，包括NH4+-N，NO2--N，COD等等，這些指標的具體數(shù)值測量均遵循相應的規(guī)程。在檢測的時候所具體使用到的方法如下表5： 表5 水質常規(guī)指標的檢測項目與方法 Table 5 Testing items and methods for conventional indexes 指標 方法 生物量（OD600） 采用超微量分光光度法在600 nm出測定 pH 玻璃電極法 氨氮（NH4+-N） 納式試劑分光光度法 硝酸鹽氮（NO3--N） 麝香草酚分光光度法 亞硝酸鹽氮（NO2--N） N-(1-萘基)-乙二胺光度法 總氮（TN） 堿性過硫酸鉀消解分

21、光光度法 化學需氧量（COD） COD儀器消解法 2.6 YG5脫氮性能研究 2.6.1種子液的制備 把YG5菌株接入到LB液體培養(yǎng)基之中，在溫度為三十度的搖床上一直進行培養(yǎng)，指導其達到生長對數(shù)期為止。菌懸液4000 r·min-1離心10 min，用無菌水清洗3次，隨后用無菌水調節(jié)菌濃度OD600值為0.60~0.80，制得種子液。 2.6.2異養(yǎng)硝化性能 把YG5菌株的種子液接種到培養(yǎng)基之中，接種量為3%，這里選擇的培養(yǎng)基中的NH4+-N的初始濃度是100mg/L，C/N=10，類型屬于異氧硝化型的，接種完成后，保持溫度一直處于三十攝氏度,經過四十八小時的培養(yǎng)，在其中，每

22、過六個小時就測定一次其中的OD600、pH值，NH4+-N、TN和COD的含量以及NO3--N、NO2--N的積累量。 2.6.3好氧反硝化性能 將YG5菌株的種子液接種到培養(yǎng)基之中，接種量為3%，這里選擇的培養(yǎng)基中的NO3--N初始濃度等于100 mg/L，C/N等于10，培養(yǎng)基類型為好氧反硝化型的，接種完成后，保持溫度一直處于三十攝氏度，經過四十八小時的培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，每過六個小時就測定一次其中的菌體生物量OD600、pH值，NO3--N、TN和COD的含量以及NH4+-N、NO2--N的積累量。 2.6.4好氧亞硝化性能 將菌株YG5的種子液接種到培養(yǎng)基之中，接種量為3%，這

23、里選擇的培養(yǎng)基中NO2--N的初始濃度等于100mg/L，C/N等于十，培養(yǎng)基類型為好氧亞硝化培養(yǎng)基，接種完成后，保持溫度一直處于三十攝氏度，經過四十八小時的培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，每過6h取樣檢測培養(yǎng)液中菌體生物量OD600、pH值，NO2--N、TN和COD的含量以及NH4+-N、NO3--N的積累量。 2.7異養(yǎng)硝化脫氮性能影響因素 2.7.1碳源對YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 在這種培養(yǎng)基中，分別使用檸檬酸鈉、乙酸鈉、琥珀酸鈉、葡萄糖、蔗糖作為碳源，無機碳源碳酸氫鈉和無碳培養(yǎng)基作為對照。把YG5菌株接種到容量為250毫升的三角瓶中，接種量為3%，瓶中含有培養(yǎng)基，其C/N=10，NH4+-

24、N濃度為100 mg·L-1，類型上屬于異氧硝化型的，接種完成后，保持溫度處于30攝氏度，150 r·min-1培養(yǎng)24h，測定菌液中菌體生物量OD600、pH值和NH4+-N、TN的含量。 2.7.2 C/N對YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 以檸檬酸鈉為碳源，C/N設為10、30、50、100、150、200。把種子液接種到容量為250毫升的三角瓶中，接種量為3%，瓶中裝有培養(yǎng)基，其類型為異氧硝化型的，其NH4+-N初始濃度為100 mg·L-1，30℃，150 r·min-1培養(yǎng)24h，測定菌液中菌體生物量OD600、pH值和NH4+-N，TN的含量。 2.7.3培養(yǎng)條件對YG5異養(yǎng)硝化性

25、能的影響 溫度，pH及裝量對YG5異養(yǎng)硝化脫氮能力的影響采用響應面法進行研究。以檸檬酸鈉為碳源，C/N為10。根據Design-Expert 8.0.6 Trial軟件中的Box-Behnken設計方法，對溫度、pH、裝量進行三因素三水平的響應面分析。根據NH4+-N去除率擬合出響應面數(shù)學模型，最終確定YG5的最適溫度、pH、裝量。采用Box-Behnken設計方法，對影響菌株脫氮效果的三個因素進行編碼，三個水平對應的編碼值分別為-1、0、1。各因素水平取值如表6： 表6 響應面實驗設計的因素和水平 Table 6 Factors and level of response su

26、rface design 編號 因素 Factor 單位 Unit 水平 Level -1 0 1 A pH - 6.5 7.5 8.5 B 裝量 mL 70 100 130 C 溫度 ℃ 28 35 42 2.7.4 NH4+-N濃度對YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 把菌株YG5接種到容量為250毫升的三角瓶中，接種量為3%，瓶中含有培養(yǎng)基，其裝量為100毫升，NH4+-N初始濃度分別為100、300、500、1000、1500、2000 mg/L，接種完成中，保持其一直處于31攝氏度，并且pH為7.5，在此種環(huán)境下培養(yǎng)七

27、天，在培養(yǎng)過程中，每二十四小時取一次樣，檢測培養(yǎng)液中菌體生物量OD600、pH值，NH4+-N和TN的含量以及NO3--N、NO2--N的積累量。 2.8好氧反硝化脫氮性能影響因素 2.8.1 C/N對YG5好氧反硝化性能的影響 將檸檬酸鈉所謂碳源，C/N設為5、10、15、20、30、50、80。把菌株YG5種子液接種到容量為250毫升的三角瓶中，瓶中裝有培養(yǎng)基，接種量為3%，培養(yǎng)基有100毫升，在接種完成以后，保持其處于三十攝氏度，經過二十四小時的培養(yǎng)，然后測定其中菌體生物量OD600、pH值以及NO3--N、TN的含量。 2.8.2 NO3--N濃度對YG5好氧反硝化性能的影響

28、 把菌株YG5種子液接種到培養(yǎng)基中，接種量為3%，培養(yǎng)基中的NO3--N濃度分別為100、300、500、800、1200、1500 mg/L，培養(yǎng)基類型為好氧反硝化型的，接種完成后，保持溫度處于三十攝氏度，經過七天的培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，每24h取樣檢測菌液中菌體生物量OD600、pH值，NO3--N和TN的含量以及NH4+-N、NO2--N的積累量。 2.8.3 C/N對YG5好氧亞硝化性能的影響 以檸檬酸鈉為碳源，C/N設為5、10、15、20、30、50、80。把YG5菌株的種子液接種到容量為250毫升的三角瓶中，接種量為3%，培養(yǎng)基的量為100毫升，類型為好氧亞硝化型的，接種完成后

29、，保持其處于三十攝氏度，經過二十四小時的培養(yǎng)后測定菌液中菌體生物量OD600、pH值以及NO2--N、TN的含量。 2.8.4 NO2--N濃度對YG5好氧亞硝化性能的影響 將YG5菌株的種子液接種到培養(yǎng)基中，接種量為3%，培養(yǎng)基中NO2--N濃度分別為100、300、500、800、1000 mg/L，類型為好氧反硝化型的，接種完成后，保持溫度處于三十攝氏度，經過七天的培養(yǎng)，每24h取樣檢測菌液中菌體生物量OD600、pH值，NO2--N和TN的含量以及NH4+-N、NO2--N的積累量。 2.9氮平衡分析 異養(yǎng)硝化好氧反硝化細菌通過兩種作用消耗氮，包括同化作用和反硝化作用，微

30、生物在生長和代謝過程中會將一些氮同化，將其存儲在細胞之內；另外有一些氮通過反硝化作用以氮氧化合物或氮氣等氣態(tài)形式逸散到外界氣體環(huán)境中[20,21]。為了更好地分析菌株YG5同化作用和反硝化作用之間的氮平衡，C/N為10，pH為7條件下，分別將菌株YG5種子液分別接種到初始NH4+-N或NO3--N濃度為100 mg/L的培養(yǎng)基中 ，接種完成后保持溫度在三十攝氏度，培養(yǎng)三天。測定未接菌時的初始TN含量，培養(yǎng)后每24h取樣離心，測上清液中的TN，為剩余溶解性氮。對沒有經過離心處理的菌液，使用超聲破碎儀來破碎，剔除其中的氮，然后測定TN。對破碎過的菌液進行離心處理，以每分鐘4000轉的速度持續(xù)十分鐘

31、，取其上清液，過濾之后用其濾液來測定最終溶解性TN、NH4+-N、NO3--N、NO2--N。計算過程遵循以下原則：菌體內部所含的氮再加上最終溶解性總氮即為最終總氮；最終溶解性有機、硝、亞硝、氨氮四者之和即為最終溶解性總氮；剩余溶解性有機、硝、亞硝、氨氮四者之和等于剩余溶解性總氮；最終總氮與溶解性總氮之間的差在初始總氮之中所占的比例即為轉化為細胞體內氮的比率；初始總氮與最終總氮的差在初始總氮之中所占的比例即為氮去除率。 3.實驗結果與分析 3.1菌種的鑒定 3.1.1形態(tài)學鑒定 YG5菌株經過二十四小時在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基之中的劃線培養(yǎng)，其培養(yǎng)結果如下圖：菌株YG5為圓形小菌落，呈

32、乳白色半透明狀，表面光滑濕潤，黏稠不易挑取。革蘭氏染色結果表明菌株YG5為革蘭氏陰性。菌株YG5透射電鏡結果如圖2所示：菌株YG5屬于短桿菌，有鞭毛，無莢膜，無芽孢。 圖1菌株YG5的菌落形態(tài) 圖2菌株YG5透射電鏡圖 Figure 1 Colony morphology of strainYG5 Figure 2 Transmission electron microscopy of strain YG5 3.1.2生理生化鑒定 測定菌株YG5的生理生化特性，結果見表7：乳糖

33、氧化發(fā)酵、尿素水解、甲基紅、V.P反應、硝酸鹽還原、綠膿菌素、吲哚實驗、石蕊牛奶、乙酸氧化、明膠液化實驗為陰性。氧化酶、接觸酶、葡萄糖氧化發(fā)酵、淀粉水解、油脂水解、檸檬酸鹽、果膠水解實驗為陽性，說明菌株YG5具有氧化酶、接觸酶、淀粉酶、脂肪酶、水解酶活性和分解葡萄糖產生有機酸和氣體，能夠利用檸檬酸鈉為碳源產生碳酸鹽的能力。初步判斷YG5與假單胞菌的生理生化特性相符。 表7 YG5菌株的生化特性 Table 7 Physiological and biochemical characteristics of strain YG5 實驗名稱 （Experimental name）

34、實驗結果 （Experimental result） 實驗名稱 （Experimental name） 實驗結果 （Experimental result） 氧化酶 + 硝酸鹽還原 － 接觸酶 + 綠膿菌素 － 葡萄糖氧化發(fā)酵 + 吲哚實驗 － 乳糖氧化發(fā)酵 － 石蕊牛奶 － 尿素水解 － 產硫化氫 － 淀粉水解 + 檸檬酸鹽 + 甲基紅 － 果膠水解 + VP － 乙酸氧化 － 油脂水解 + 明膠液化 － 注：表中 “+”代表陽性，發(fā)生了這種反應；“－”代表陰性，沒有發(fā)生這種反應。 3.1.3 分子生物學鑒

35、定 菌株YG5 16S rRNA和napA基因的PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳成像，得到了如圖3的試驗結果，從中可以明顯的看出其PCR產物的條帶亮度更高，其中沒有蘊含雜質，條帶位置分別在1000~2000、750~1000 bp之間，說明獲得目標產物。然后對其產物純化，測序處理，分析其結果的同源性，這里使用的分析方法是BLAST程序，通過MEGA7將系統(tǒng)的發(fā)育樹描繪出來。下圖4和圖5為其繪制成果：菌株YG5的16S rRNA基因序列與Pseudomonas sihuiensis KCTC 32246序列同源性為99.57%；napA基因與Pseudomonas sihuiensis KCTC

36、 32246的序列同源性最高，為99.67%?？紤]其本身在形態(tài)上以及生理上的一些特征將其命名為Pseudomonas sihuiensis YG5，以下簡稱為YG5。 圖3菌株YG5的16S rRNA與napA基因PCR電泳圖 Figure 3 16S rRNA and napA gene PCR electrophoretic map of strain YG5 圖4基于16s rRNA序列同源性構建菌株YG5的系統(tǒng)發(fā)育樹 Figure 4 Phylogenetic tree of strain YG5 was constructed based on the h

37、omology of 16s rRNA sequence 圖5基于napA序列同源性構建菌株YG5的系統(tǒng)發(fā)育樹 Figure 5 Phylogenetic tree of strain YG5 was constructed based on napA sequence homology 3.2菌種YG5脫氮性能結果 3.2.1異養(yǎng)硝化性能結果 異養(yǎng)硝化培養(yǎng)體系中，以NH4+-N為氮源，菌株YG5生長和脫氮性能變化結果如圖6所示：0~12h，菌株的生物量增長迅速，OD600從0.05增長至0.43，為對數(shù)生長期；18h，生物量達到最大值，OD600為0.45；隨后生長曲線

38、較為平緩，進入穩(wěn)定生長期。體系的pH值隨培養(yǎng)時間的增加而逐漸遞增，從初始的7.13提高到8.77，說明YG5生長過程中產堿。這與目前報道的許多異養(yǎng)硝化菌類似，例如Acinetobacter calcoaceticus N7培養(yǎng)的24h，pH從7.50上升至8.80[22]；Pseudomonas aeruginosa YL培養(yǎng)的24h，pH從7.00增長至9.00[23]；Alteromonas macleodii 8D在培養(yǎng)的48h中，pH無明顯變化，基本維持在7.57[24]。 0~12h，菌株YG5對NH4+-N和TN降解迅速，NH4+-N去除速率最高達8.37 mg·(L·h)-1，

39、NO3--N開始積累；12~30h，菌株YG5對NH4+-N和TN降解緩慢；30h，菌株YG5對NH4+-N去除率為100.00%，TN的去除率最高達96.57%。菌株YG5的異養(yǎng)硝化與生長規(guī)律一致，這說明氮的去除與菌體生長有很大的關系，該結果與Alcaligenes faecalis Ni3-1，Pseudomonas sp．DK1的脫氮作用主要發(fā)生在對數(shù)生長期情況一致[25,2627]。另外，菌株YG5異養(yǎng)硝化過程中幾乎沒有NO3--N，NO2--N的積累，這與Klebsiella sp.y6情況相一致[28]。一般異養(yǎng)硝化菌，適應期長，不能在短時間內將體系中的氮完全去除，例如在初始NH4

40、+-N濃度都為100 mg·L-1的情況下，Pseudomonas putida YH培養(yǎng)48h NH4+ -N 去除率為98.90%[17]，Acinetobacter sp JQ1004 33h菌株NH4+ -N 去除率為 99.45%[29]，而YG5僅需30h NH4+ -N 去除率就能達到100.00%，說明YG5的NH4+-N去除速率更高，具有較強的脫氮性能。 圖6 YG5異養(yǎng)硝化性能變化情況 Fig. 6 Change of YG5 heterotrophic nitrification performance 3.2.2好氧反硝化性能結果 好氧反硝化培養(yǎng)體系中，菌株

41、YG5以NO3--N為氮源，其生長和脫氮性能變化結果如圖7所示：0~18h，菌株YG5生物量增長迅速，為對數(shù)生長期，在18小時的時候上升到最高值，OD600為0.35；18~24h處于下降的狀態(tài)，這是因為碳源不足，代謝產物累積，抑制菌的生長；24h后，菌株YG5生長曲線較為平緩，處于穩(wěn)定期。0~18h，NO3--N，TN的去除率逐漸增加，NO2--N積累量為1.32 mg·L-1，反應過程中還伴有少量的NH4+-N積累；18h，NO3--N與TN的去除率分別達到77.80%和64.76%；18~48h，NO3--N和TN降解緩慢；24h，TN的去除率最高達68.81%；36h，NO3--N最高

42、達78.43%；48h，NH4+-N積累量為3.20 mg·L-1，NO2--N積累量為1.10 mg·L-1。大部分異氧硝化好氧反硝化菌在通過NO3--N來發(fā)生以及反硝化的過程中，同時檢測到中間產物NO2--N的積累。例如Pseudomonas sp. CD1在初始NO3--N濃度為253.50 mg·L-1的情況下，培養(yǎng)48h后NO2--N的積累量為3.20 mg·L-1[29]；Pseudomonas aeruginosa YL在初始NO3--N濃度為200 mg·L-1的情況下，培養(yǎng)48h后NO2--N的積累量為59.90 mg·L-1[30]；Pseudomonas putida Y

43、H在初始NO3--N濃度為100 mg·L-1的情況下，培養(yǎng)48h后所積累的NO2--N最終完全去除[17]。以上結果表明，NO2--N是異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌好氧反硝化脫氮過程的中間產物。 圖7 YG5 好氧反硝化性能變化情況 Fig. 7 Change of YG5 aerobic denitrification performance 3.2.3好氧亞硝化性能結果 好氧亞硝化培養(yǎng)體系中，YG5以NO2--N為氮源，生長和脫氮性能變化規(guī)律如圖8所示：0~6h，菌株YG5生物量增長較慢，為菌株生長適應期；6~12h，菌株YG5生物量增長迅速，為菌株對數(shù)生長期； 42h OD600最

44、大達0.38；42~48h，菌株YG5生物量開始下降，菌株進入生長衰亡期。0~18h，NO2--N，TN的去除率增長迅速，在反應的時候會有不多的NH4+-N和NO2--N生成；在18h的時候，NO2--N去除掉了74.29%，TN去除掉了75.21%；在18~30h這段時間內，開始降解，但是降解速度并不高，在30h的時候兩者的去除率達到極限值82.12%，76.73%；30h后，NO2--N，TN的去除率逐漸降低；48h，NH4+-N的積累量達到了11.03 mg·L-1，而NO3--N幾乎沒有積累。好氧亞硝化過程中有少量的NH4+-N積累，這部分氮源可能來自于少量衰亡的細菌，例如Altero

45、monas macleodii 8D好氧亞硝化過程中也檢測到 NH4+-N的明顯積累，40h NH4+-N濃度達3.11 mg·L-1，48h下降至1.99 mg·L-1[24]；Arthrobacter arilaitensis Y-10好氧亞硝化過程中有微量NH4+-N積累[31]。YG5的好氧反硝化性能變化規(guī)律與好氧亞硝化性能變化規(guī)律相似。這與Pseudomonas sp.y3對NO3--N和NO2--N的利用情況相似[32]，而Bacillus hwajinpoensis SLWX2好氧亞硝化性能強于好氧反硝化性能[33]，綜上所述，不同種屬的異養(yǎng)硝化菌對NO3--N或NO2--N的利

46、用情況存在差異。 圖8 YG5好氧亞硝化性能變化情況 Fig. 8 Change of YG5 aerobic nitrification performance 3.3異養(yǎng)硝化脫氮性能影響因素 3.3.1碳源對YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 在微生物的正常生長周期中，C是一種不可或缺的營養(yǎng)物，在其組織結構中發(fā)揮著重要作用，在生命活動活動中也是一種重要的能量來源。來源于不同途徑的碳隨此種菌株的脫氮性能所造成的影響在圖9中可以體現(xiàn)出來：在碳來源于檸檬酸鈉的時候，此種菌種的OD600值最高，能夠達到0.31，NH4+-N和TN去除率最大分別達到89.48%和81.92%；以琥珀酸鈉

47、為碳源時，菌株YG5 OD600值為0.30，兩者的去除能夠達到82.98%和78.09%。在碳來源于乙酸鈉或者草酸鈉的時候,OD600分別為0.10、0.06，對來自乙酸鈉的碳源，兩者的去除率能夠達到25.99%和25.29%，對來自于草酸鈉的碳源，兩者的去除率能夠達到3.48%和3.03%，這說明了在碳來源于有機酸的時候，菌株YG5生物量比較高，脫氮效果較好。當碳源是葡萄糖，蔗糖時，菌株YG5基本沒有增長。以碳酸氫鈉為碳源時，OD600為0.06，NH4+-N去除率為50.23%，說明菌株YG5可以利用無機碳源，具有自養(yǎng)硝化的能力，但無機碳源不適合菌株YG5的生長和NH4+-N去除。綜上，

48、選擇檸檬酸鈉為菌株YG5脫氮性能研究的碳源。 菌株YG5與目前報道大部分異養(yǎng)硝化菌一樣，相對于糖類，更容易高效利用有機酸。原因是琥珀酸鈉與檸檬酸鈉是微生物將復雜有機物轉化為簡單小分子有機物時三羧酸循環(huán)中的中間產物，可以直接參與TCA循環(huán)，而糖類需要轉化為有機酸再利用[35]，小分子的有機酸碳更適合y6菌的生長[28]；國內學者林而舒等人曾經針對過碳源的不一致與異氧硝化能力之間的關系，其中NH4+-N的濃度為100mg/L，以檸檬酸鈉作為碳源，菌株Enterobacter asburiae YB NH4+-N去除率最大達81.20%。但不同種屬的異養(yǎng)硝化菌對碳源的利用情況也不盡相同，例如Bac

49、illus pumilus BP-171以葡萄糖為碳源，NH4+-N的去除效果最佳，培養(yǎng)12h NH4+-N去除率達74.07%[36]；Diaphorobacter sp. PDB3以苯酚為碳源，當初始NH4+-N為40 mg·L-1時，培養(yǎng)21h NH4+-N完全去除[37]。 圖9 碳源對菌株YG5生長及異養(yǎng)硝化性能的影響 Fig. 9 Effect of carbon sources on growth and heterotrophic nitrification of strain YG5 3.3.2 C/N對YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 C/N值的高低會對其

50、性能帶來影響，結果如圖10所示:當C/N為10~30時，菌株YG5 OD600都達到0.35以上；C/N從30增加至200時，菌株YG5 菌體OD600明顯下降，由0.36下降到0.08。當C/N為10~30時，兩者的去除率不低于95%，在C/N提高到50、100、150、200時，NH4+-N去除率出現(xiàn)了一定的降低，分別為56.87%、33.30%、19.30%、16.89%。綜上所述，菌株YG5最適C/N范圍為10~30。C/N對菌株的生長和NH4+-N降解有顯著影響，由于菌株的多樣性與代謝機理的不同，異養(yǎng)硝化菌C/N的適應范圍也不同[11]。例如當初始NH4+-N濃度為100 mg·L-

51、1時，Enterobacter asburiae YT C/N的最適范圍是10~12，當C/N為12，OD600與NH4+-N去除率最高分別達到1.94和98.90%[38]；Pseudomonas aeruginosa YL C/N的最適范圍是10~15，當C/N為10，OD600與NH4+-N去除率最高分別達到1.38和90.80%[23]。綜上所述，與 YT、YL相比，菌株YG5在高碳氮比下脫氮更具有優(yōu)勢，說明了菌株YG5在高負荷碳源條件下可以高效的脫氮，具有潛在的廢水處理應用優(yōu)勢與潛能。

52、

53、 圖10 C/N對菌株YG5生長及異養(yǎng)硝化性能的影響 Fig.10 Effect of C/N on the growth and heterotrophic nitrification of strain YG5 3.3.3培養(yǎng)條件對YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 (1)實驗方案與結果 以pH（A），裝量（B），溫度（C）這三個參數(shù)作為自變量，以NH4+-N去除率作為因變量，通過Box-Behnken試驗以后，所得到的試驗結果在下表中羅列了出來： 表8 響應面實驗設計方案及結果 Table 8 Design scheme

54、and result of response surface experiment 編號 Number pH（A） 裝量（mL）（B） Loading capacity 溫度（℃）（C） Temperature NH4+-N去除率（%） NH4+-N removal rate 1 0 0 0 97.92 2 1 0 1 82.96 3 0 1 -1 83.28 4 0 0 0 96.58 5 0 0 0 96.58 6 1 1 0 81.39 7 -1 0 -1 94.15 8 1 -1 0

55、93.04 9 -1 -1 0 93.09 10 -1 0 1 78.81 11 0 0 0 95.78 12 0 -1 1 76.25 13 0 1 1 73.01 14 0 -1 -1 95.33 15 1 0 -1 95.76 16 0 0 0 97.65 17 -1 1 0 80.99 (2)方差分析 利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件對實驗數(shù)據進行多元線性回歸擬合，得到擬合二次回歸模型方程： R1=96.90+0.76A-4.88B-7.19C+0.

56、11AB+0.63AC+2.20BC-1.91A2-7.86B2-7.07 C2 其中R1代表氨氮去除率，A，B，C分別代表pH，裝量，溫度的編碼值。對上述模型方程進行方差分析，其結果如表9所示： 表9 實驗結果方差分析 Table 9 Variance analysis of experimental results 方差 來源 平方和 Sum of Squares 自由度 df 均方 Mean Square F值 F Value p值 P value 模型 1157.86 9 128.65 56.86 ** A 4.67 1

57、 4.67 2.06 0.19 B 190.51 1 190.51 84.20 ** C 413.08 1 413.08 182.56 ** AB 0.053 1 0.053 0.023 0.88 AC 1.60 1 1.60 0.71 0.42 BC 19.37 1 19.37 8.56 * A2 15.37 1 15.37 6.79 * B2 260.29 1 260.29 115.04 ** C2 210.47 1 210.47 93.02 ** 殘差 15.84 7 2.26

58、 失擬項 12.78 3 4.26 5.58 0.06 純誤差 3.06 4 0.76 總誤差 1173.70 17 注：*為顯著（p<0.05），**為極顯著（p<0.01） 模型的p<0.01，為極顯著，說明用響應面法建立的回歸模型是有意義的。失擬項的p>0.05，說明無失擬因素存在，這個回歸模型擬合出來曲線具備了比較好的擬合度，因此通過這個模型來研究分析實驗結果是可行的。在進行過方差分析以后，能夠發(fā)現(xiàn)B，C（p<0.01），顯然差異極大，二次項B2，C2（p<0.01）也顯然差異極大；BC（p<0.05）顯然差異極大，AB，AC（p>

59、0.05）沒有明顯的差異。這能夠看出各個因素之間對響應值并不是單一的線性關系，且對響應值的影響存在一個極值點，這個極值點正是最佳條件[39]。根據模型方程可預測當pH為8.07，250 mL三角瓶裝量為82.61 mL，溫度為31.67℃時，反應體系的異養(yǎng)硝化能力為最佳。 (3)模型分析 將三種因素分別進行兩兩的分析比較，然后經過回歸分析，將等高線圖和響應面圖繪制出來，在等高線圖中，可以根據其形狀來判斷相互作用的大小，若是等高線表現(xiàn)為圓形，則表示了沒有顯著的作用，若等高線表現(xiàn)為橢圓形，則表示了相互作用是顯著的，在所有橢圓中，面積最小的一個的中心點即為響應面的最高點[35,40]。響應面的作

60、用在于當某一變量的編碼值處于0時，可以看出其余兩個獨立變量之間的相互影響[35]。 pH與裝量對菌株YG5 NH4+-N去除率的相互影響結果如圖11(a)所示：等高線的形狀為橢圓形，說明當溫度一定時，pH與裝量之間的交互作用顯著。整體響應面較為陡峭，響應值隨著裝量的變化率大于隨著pH的變化率，表示裝量比pH對菌株YG5 NH4+-N去除率的影響程度大。pH和溫度對菌株YG5 NH4+-N去除率的相互影響結果如圖11(b)所示：在等高線圖中，可以發(fā)現(xiàn)圖線多呈橢圓，說明了pH與溫度之間有顯著的影響關系，其響應面不平緩，在溫度發(fā)生改變的時候，響應值改變量更大，說明溫度比pH對NH4+-N去除率的影

61、響程度大。裝量和溫度對菌株YG5 NH4+-N去除率的相互影響結果如圖11(c)所示：在等高線圖中，其圖線多為橢圓，說明裝量溫度之間有顯著的影響關系，其響應面不陡峭，響應值隨著溫度的變化率與隨著pH的變化率相當，表示裝量與溫度對NH4+-N去除率的影響程度相當。 c b a 圖11 各交互項影響NH4+-N去除率的等高線圖和響應面圖 Fig.11 Each interaction term affects the contour plot and response surface plot of NH4+-N removal rate (4

62、) 、模型驗證 以響應面的形態(tài)來對此種菌株的最佳脫氮條件進行分析：pH 8.07，裝量為250 mL三角瓶約裝82.61 mL，溫度 31.67℃，此時NH4+-N去除率預測值為96.58%。為驗證模型預測的準確性和有效性，在最優(yōu)條件下進行三組水平實驗，150 r·min-1培養(yǎng)24h，測得實際平均NH4+-N去除率為99.11%?？梢妼嶋H值與回歸方程所得到的理論值非常接近，菌株YG5優(yōu)化后NH4+-N去除率與優(yōu)化前相比提高了16.13%。同時，檢測了菌株YG5優(yōu)化后TN去除率為98.39%，與優(yōu)化前TN去除率相比較提高了20.30%。以上結果表明采用響應面法優(yōu)化菌株YG5的脫氮條件，取得了

63、良好的效果。 3.3.4 NH4+-N濃度對YG5異養(yǎng)硝化性能的影響結果 下圖12表示了NH4+-N的濃度大小的變化對此種菌株的生長情況或者異氧硝化脫氮性能所能夠造成的影響：剛開始NH4+-N濃度大小值等于100、300、500、1000、1500、2000 毫克每升，菌株YG5異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中持續(xù)培養(yǎng)七天：在NH4+-N的濃度處于一百到三百毫克每升的區(qū)間內的時候，此種菌株的生物量隨著氮濃度的增加而增加，OD600由0.98上升到2.23；當NH4+-N濃度為300~2000 mg·L-1時，菌株生物量發(fā)生明顯的降低，OD600由2.23下降到0.06，說明氮濃度過高對菌的生長和脫氮性能產

64、生抑制作用，抑制了菌株的生長代謝以及有效反應。當NH4+-N濃度為100~500 mg·L-1時，NH4+-N，TN去除率達97.00%以上，其中NH4+-N濃度為500 mg·L-1時，兩者的去除率達到極限值，分別為百分之一百和百分之九十八；當NH4+-N在每升溶液中的含量為一千、一千五、兩千毫克的時候，隨著氮越來越濃，其去除率越來越低，分別為35.07%、7.83%、10.31%。同時，測定了NO3--N，NO2--N積累情況，結果表明無論是高氮負荷還是低氮負荷二者都無明顯積累。綜上所述，菌株 YG5 能夠適應較寬范圍的NH4+-N負荷，在高NH4+-N負荷下仍具有較高的異養(yǎng)硝化能力，高于

65、目前報道的一些好氧反硝化菌株，例如當初始NH4+-N濃度為20~160 mg·L-1時，Pseudomonas alcaliphila AD-28用來去除NH4+-N的時候，去除效果很好，可以達到百分之九十，在NH4+-N的每升含量上升到兩百毫克的時候，Pseudomonas putida YH對N的去除效果很好，可以達到百分之九十八，在NH4+-N的每升含量提高到五百毫克的時候，其去除率降低為三分之二[17]，在NH4+-N的每升含量不低于五十毫克，不超過一百毫克的時候，Acinetobacter sp YN3能夠起到很好的去除效果，對；NH4+-N能夠達到百分之九十八的去除率。在其每升含量

66、提高至一百五十毫克的時候，去除率降低到百分之十九[42]。比起前面所說的這些菌株來說，YG5在處理含量比較高的污水方面具備相當強的潛力。 圖12 NH4+-N濃度對YG5異養(yǎng)硝化脫氮性能的影響 Fig. 12 Effect of NH4+-N concentration on nitrogen removal by heterotrophic nitrification of YG5 3.4好氧反硝化脫氮性能影響因素 3.4.1 C/N對YG5好氧反硝化性能的影響結果 C/N是衡量反硝化體系中電子供體和電子受體比率的指標，是好氧反硝化細菌在呼吸過程中獲得高效脫氮效率的重要因素[42]。不同C/N對菌株YG5的生長情況以及好氧反硝化脫氮的影響結果如圖13所示:當C/N為5~30時，菌株YG5 OD600隨著C/N的增加而增加，這是由于低的碳源含量不能滿足菌株YG5的生長，其中C/N為30時，YG5 OD600最大達到0.88；當C/N為50和80時，菌株YG5 OD600隨著C/N的增加而降低，分別為0.75和0.59，說明碳源已經超過了菌體所需的量，對菌株生長產生了一定抑