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1、雞的大小黃白卵泡分離及總RNA的提取 目錄 中文摘要： 2 關(guān)鍵詞： 2 Abstract： 2 前言 2 1.材料和方法 4 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其組織 4 1.2主要儀器和試劑 4 1.2.1實(shí)驗(yàn)儀器 4 1.2.2實(shí)驗(yàn)試劑 4 1.2.3溶液配制 5 1.3實(shí)驗(yàn)操作步驟 5 1.3.1取樣 5 1.3.2大小黃白卵泡的提取 6 1.3.3總RNA的提取 6 1.3.4總RNA完整性鑒定 6 1.3.5 總RNA內(nèi)基因組DNA的去除 6 1.3.6反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 7 1.3.7 PCR反應(yīng) 7 1.3.8 電泳檢測(cè) 7 1.3.9 PCR產(chǎn)物純化 7 1

2、.3.10 連接轉(zhuǎn)化 8 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)論 8 2.1 雞卵泡顆粒細(xì)胞 8 2.2 總RNA的檢測(cè)結(jié)果 9 2.3 PCR檢測(cè) 9 3.分析討論 10 4.參考文獻(xiàn) 12 中文摘要： 實(shí)驗(yàn)前,在大量查閱各項(xiàng)相關(guān)研究資料的前提下，明確了CART與蛋雞卵巢中不同大小黃白卵泡中的雌激素（Estrodiol, E2）和孕酮（P）分泌量的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用顯微外科手術(shù)技術(shù)分離蛋雞的大小黃卵泡、大小白卵泡，并分別進(jìn)行總RNA的提取，通過(guò)CART mRNA表達(dá)量的差異對(duì)CART蛋白進(jìn)行定位，再通過(guò)體外注射dsRNA對(duì)CART的表達(dá)進(jìn)行抑制，阻斷CART

3、對(duì)蛋雞卵巢中卵泡生長(zhǎng)發(fā)育及排卵的影響，從而提高蛋雞產(chǎn)蛋量，延長(zhǎng)產(chǎn)蛋周期，降低料蛋比，進(jìn)而通過(guò)飼養(yǎng)試驗(yàn)，確定調(diào)控效果，并將該技術(shù)進(jìn)行全面示范推廣。 關(guān)鍵詞：CART；卵泡；總RNA；dsRNA； Abstract： According to the information of related research before experiments, we found out the relationships between the amount of estrogen(E2) and progesterone(P), which the layer’s follicle in di

4、fferent size secreted ,and CART. During this experiment ,we used the microsurgical technique to isolate different follicles including Rhubarb follicle(LYF) , Small white follicle (SWF), yellow follicle (SYF) and the follicle (LWF).Otherwise, we have picked up the total RNA respectively and located t

5、he CART protein through the different amount of CART expression. Finally, we have suppressed the influences of CART on the follicles’ growth and ovulation in ovarian by means of injecting dsRNA artificially .As to improve the layers’ production, prolong period of laying and reduce the ratio of forag

6、e and eggs, we conducted the feeding experiments and determined the effect of the results, and then apply comprehensively to the actual producatons. Key words：CART(Classification And Regression Tree)；folliole；total RNA； 前言 我國(guó)蛋雞已由上世紀(jì)80~90年代的數(shù)量蓬勃發(fā)展階段，逐步進(jìn)入微利時(shí)代，蛋雞養(yǎng)殖的行業(yè)優(yōu)勢(shì)、價(jià)格優(yōu)勢(shì)也日趨降低，并開(kāi)始按發(fā)展——競(jìng)爭(zhēng)——平穩(wěn)運(yùn)行

7、三個(gè)階段經(jīng)濟(jì)模式運(yùn)作。目前蛋雞產(chǎn)業(yè)在精細(xì)化的管理、先進(jìn)技術(shù)的應(yīng)用及市場(chǎng)信息的支撐方面，逐漸發(fā)展成熟、完善。因此，要想提高蛋雞養(yǎng)殖利潤(rùn)就要從根本上提高蛋雞的產(chǎn)蛋量，降低料蛋比。 卵巢周期是產(chǎn)蛋過(guò)程的中心事件，只有成熟卵巢的卵泡才能釋放卵子，然而，大于99%的卵巢卵泡在其發(fā)生過(guò)程中死亡而不能排卵。促卵泡素（FSH）啟動(dòng)原始卵泡發(fā)育后，又進(jìn)一步促進(jìn)部分卵泡形成腔，進(jìn)入有腔卵泡的生長(zhǎng)期。在對(duì)牛的卵泡發(fā)育研究中表明，當(dāng)原始卵泡發(fā)育到了3~4mm有腔卵泡期，通常就會(huì)出現(xiàn)一次FSH水平的瞬時(shí)提高。有腔卵泡的繼續(xù)生長(zhǎng)依賴(lài)于FSH的支持，F(xiàn)SH刺激有腔卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)又刺激顆粒細(xì)胞產(chǎn)生FSH受體（FSHR

8、），隨著FSHR數(shù)量的增加，卵泡顆粒細(xì)胞對(duì)FSHR反應(yīng)也就越大，從而促使顆粒細(xì)胞不斷發(fā)育。FSH短暫的增加，并刺激一群小的有腔卵泡開(kāi)始發(fā)育，這是一個(gè)卵泡發(fā)育波的開(kāi)始，其中只有一個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡繼續(xù)發(fā)育到排卵的大小，這時(shí)FSH的濃度下降，并產(chǎn)生大量的雌激素（Estrodiol, E2），而其余的從屬卵泡失去了產(chǎn)生E2的能力，并通過(guò)卵泡閉鎖而死亡。近年來(lái)許多實(shí)驗(yàn)證明，在卵泡發(fā)育過(guò)程中，雌激素起著關(guān)鍵作用。E2不僅能提高卵泡對(duì)FSH的攝取，而且還可以通過(guò)提高FSH的濃度來(lái)刺激cAMP的積累能力，從而進(jìn)一步提高卵巢卵泡顆粒細(xì)胞對(duì)FSH的反應(yīng)性，還能增進(jìn)FSH刺激其受體作用，能使顆粒細(xì)胞促黃體生成素受體明顯增

9、加，大大提高卵泡對(duì)兩種促性腺激素的反應(yīng)性，最終促使卵泡發(fā)育成熟并排卵。卵巢內(nèi)卵泡E2產(chǎn)生能力的喪失導(dǎo)致卵泡閉鎖。卵巢內(nèi)雌激素產(chǎn)生是垂體促性腺激素和卵泡內(nèi)調(diào)控分子的相互作用調(diào)控的，如類(lèi)固醇激素和生長(zhǎng)因子。 蛋雞卵巢大約包含4000個(gè)原始卵泡，每個(gè)原始卵泡都有潛力形成一枚蛋黃，但只有不足1/4卵泡能夠發(fā)育成熟和排卵，而蛋雞企業(yè)中每只蛋雞產(chǎn)蛋期內(nèi)排卵約500~550枚，卵巢上大量參與發(fā)育的卵泡在其發(fā)生過(guò)程中閉鎖和退化。卵泡發(fā)育過(guò)程中，垂體分泌的促性腺激素（E2和FSH）起著重要作用，促進(jìn)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)、卵泡細(xì)胞的增殖和卵泡腔的形成以及誘導(dǎo)卵泡排卵、黃體生成。近年來(lái)實(shí)驗(yàn)證明甾類(lèi)激素，特別是E2對(duì)調(diào)控

10、卵泡發(fā)育和黃體生成過(guò)程也起著重要的作用。蛋雞卵巢E2對(duì)于卵泡的遞次發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用，當(dāng)卵巢上有最大卵泡存在的時(shí)候，其分泌的E2在垂體前葉抑制FSH和排卵誘導(dǎo)素（OIH）的分泌，對(duì)其它中小卵泡的發(fā)育起到抑制作用。但是，在高產(chǎn)家禽，其體內(nèi)E2的含量也相對(duì)較高，因?yàn)檫@些家禽的卵巢上同時(shí)有數(shù)量較多的大中型卵泡存在，而E2主要是由大中型卵泡分泌的。而孕酮（P）能夠刺激卵泡壁細(xì)胞的蛋白分解酶和膠原水解酶的合成，這兩種酶分解卵泡壁細(xì)胞而引發(fā)排卵。同時(shí)，P對(duì)OIH的釋放也有作用。大劑量的P由于能夠抑制FSH和OIH的分泌，對(duì)卵泡發(fā)育和排卵會(huì)起到抑制作用。 CART是近年來(lái)在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性神經(jīng)

11、肽，參與人和動(dòng)物多方面的生理功能。Spiess等 (1981) 在羊下丘腦的抽提物中分離出CART，Western Blotting 也證實(shí)了CART肽在腦、內(nèi)臟、腎上腺、垂體等處均有分布。近年來(lái)美國(guó)密歇根大學(xué)研究人員在對(duì)牛的研究中首次證實(shí)CART對(duì)卵泡健康狀況有負(fù)調(diào)節(jié)作用，并且CART對(duì)牛顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的E2的基本含量也有負(fù)調(diào)控作用。同時(shí)，CART抑制牛顆粒細(xì)胞內(nèi)由FSH誘導(dǎo)的cAMP水平、E2的積累和芳構(gòu)化酶信使RNA水平的升高，從而引起顆粒細(xì)胞的凋亡并最終引起卵母細(xì)胞的閉鎖。李鵬飛（2011）以豬、羊?yàn)檠芯繉?duì)象，首次證明了CART在豬、羊卵巢中有表達(dá)，并對(duì)該基因全CDS區(qū)進(jìn)行了克隆與表達(dá)載

12、體的構(gòu)建，目前已通過(guò)對(duì)豬、綿羊卵巢卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)，研究CART與E2產(chǎn)生的相互關(guān)系。 dsRNA是一種有互補(bǔ)鏈的RNA，與細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的DNA相似，dsRNA能夠促發(fā)真核細(xì)胞中的RNA干擾，在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)同源序列的基因表達(dá)受到抑制，引起脊椎動(dòng)物中的干擾素反應(yīng)。目前RNA干擾技術(shù)在科學(xué)界受到極大關(guān)注，主要是因?yàn)樵擁?xiàng)技術(shù)在干擾基因功能和相關(guān)方面的應(yīng)用中具有許多傳統(tǒng)方法無(wú)法比擬的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)：（1）特異性 dsRNA干擾技術(shù)的最顯著特征就是只引起與dsRNA同源的mRNA降解。實(shí)驗(yàn)表明，dsRNA能穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因和細(xì)胞內(nèi)自身固有的內(nèi)源基因表達(dá)，而對(duì)其它無(wú)關(guān)基因的表達(dá)不受影響；（2）高效性 無(wú)

13、論是在體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)中，僅需少量的dsRNA就能有效的抑制靶基因表達(dá)，其介導(dǎo)的RNA干擾是一個(gè)以催化放大的方式進(jìn)行的；（3）dsRNA長(zhǎng)度限制性 引發(fā)有效的RNA干擾的dsRNA最短不得短于21堿基，同時(shí)長(zhǎng)鏈dsRNA也在細(xì)胞內(nèi)被Dicer酶切割為21nt左右的siRNA，并由siRNA來(lái)介導(dǎo)mRNA切割；（4）可傳播性 dsRNA具有跨越細(xì)胞界限的能力，在局部注射dsRNA，能夠傳播到整個(gè)機(jī)體；（5）ATP依賴(lài)性 dsRNA干擾是一個(gè)ATP依賴(lài)的過(guò)程，整個(gè)過(guò)程由ATP提供能量。 目前雖然仍未找到CART的受體，但已經(jīng)明確CART實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能的途徑就是與其受體結(jié)合，如果通過(guò)阻斷C

14、ART與其受體結(jié)合或能夠抑制CART的合成和表達(dá)，對(duì)于蛋雞產(chǎn)業(yè)而言，無(wú)疑是一項(xiàng)重大技術(shù)發(fā)現(xiàn)。 1.材料和方法 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其組織 本實(shí)驗(yàn)材料均來(lái)自晉中市太谷縣屠宰場(chǎng)。選取十只健康蛋雞組成實(shí)驗(yàn)群。待蛋雞宰殺后，取下所有的十個(gè)卵巢，投入冰盒中制備好的杜氏磷酸緩沖液（DPBS）中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。 1.2主要儀器和試劑 1.2.1實(shí)驗(yàn)儀器 表一 實(shí)驗(yàn)儀器 儀器名稱(chēng) 型號(hào) 生產(chǎn)廠家 制冰機(jī) SIM-F124 SANYO 超低溫冰箱 UF-3410 Thermo 超凈工作臺(tái) DL-CG-2ND 哈東聯(lián) 電熱恒溫干燥箱 DEF-6210 上海一恒 高速冷凍離

15、心機(jī) Centrifuge 5810R Eppendorf 凝膠成像分析系統(tǒng) GBS-7600B BIO-RAD PCR 擴(kuò)增儀 PTC200 TaKaRa 電泳儀、電泳槽 DYY-Ⅲ-12B 六一 核酸蛋白檢測(cè)系統(tǒng) ND-100 Nanodrop 恒溫振蕩培養(yǎng)箱 LRH-250E 廣東醫(yī)療器械廠 超純水系統(tǒng) NW10VF Healforce 將需要清除RNase槍頭、離心管等放入固相RNase清除劑工作液浸泡5 min以上，烘干備用。 1.2.2實(shí)驗(yàn)試劑 表二.實(shí)驗(yàn)試劑 試劑 貨號(hào) 出產(chǎn)公司 固相RNase清除劑 107105zyh

16、 Andybio Total RNA提取試劑 D9108A Takara 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 DRR047A Takara 膠回收試劑盒 DV805A Takara 連接轉(zhuǎn)化試劑盒 D102A Takara 感受態(tài)大腸桿菌DH5α D9057 Takara Taq DNA Polymerase ET101-01 北京天根生化科技有限公司 dNTP Mixture CD117 北京天根生化科技有限公司 1.2.3溶液配制 (1) DPBS溶液：500 mL 蒸餾水 + 4 g NaCl + 0.1 gKCl + 0.1 g KH2PO4

17、+ 0.575 g Na2HPO4，溶解后高壓滅菌備用。 (2) 50 × TAE Buffer：242 g Tris，37.2g EDTANa2，57.1 mL冰乙酸，NaOH溶液調(diào)pH至8.3，加去離子水定容至1 L后室溫保存。使用時(shí)稀釋50倍。 (3) 固相RNase清除劑：將蒸餾水與固相RNase清除劑按1000:1配制，室溫下可保存24 h。 (4) EB儲(chǔ)液 (10 mg/mL)：1 g EB溶于100 mL去離子水，4 ℃棕色瓶避光保存。 (5) LB液培養(yǎng)基1000 mL：蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，NaOH調(diào)pH至7.4，去離子水定容至1

18、L，高溫高壓濕熱滅菌后4 ℃保存，用前37 ℃平衡。 (6) LB固體培養(yǎng)基1000 mL：蛋白胨 10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，Agar 15 g，NaOH調(diào)pH至7.4，去離子水定容至1000mL，高溫高壓濕熱滅菌，溫度至60 ~ 65 ℃鋪板，冷卻后4 ℃保存，用前37 ℃平衡。 (7) 氨芐青霉素(100 mg/mL)：氨芐青霉素5 g，滅菌水定容至50 mL，0.22 mm過(guò)濾膜過(guò)濾除菌，保存于﹣20 ℃。 (8) X-Gal (20 mg/ml)：1 g X-Gal，二甲基甲酰胺定容至50 mL，﹣20 ℃保存。 (9) IPTG (24 mg/mL)：I

19、PTG 1.2 g，滅菌水定容至50 mL，0.22 mm過(guò)濾膜過(guò)濾除菌，﹣20 ℃保存。 1.3實(shí)驗(yàn)操作步驟 1.3.1取樣 （1）取卵泡：在細(xì)胞培養(yǎng)室將盛70%酒精和DPBS溶液兩個(gè)小培養(yǎng)皿放于紙巾上，一小燒杯內(nèi)盛少量的培養(yǎng)液放于冰上。用眼科手術(shù)剪輕輕剪取2 ~ 8 mm卵泡，將剪下的卵泡在70%酒精和DPBS溶液中各浸數(shù)秒后，用鑷子夾入盛有培養(yǎng)液的燒杯內(nèi)。 （2）刮取顆粒細(xì)胞：超凈臺(tái)內(nèi)放入盛冰的大燒杯，內(nèi)放盛有卵泡的小燒杯和幾只采血管，針管和膠頭滴管放入采血管內(nèi)。滅菌好的表面皿、刮刀、小剪刀、兩把鑷子和垃圾杯放入超凈臺(tái)內(nèi)。將卵泡夾入表面皿，注入少量培養(yǎng)液，鑷子夾住卵泡用針管刺破，

20、小剪刀剪開(kāi)卵泡后刮刀刮其內(nèi)壁將顆粒細(xì)胞刮下，膠頭滴管吸取細(xì)胞懸液至采血管中，殘留物棄于垃圾杯，如此反復(fù)。 1.3.2大小黃白卵泡的提取 禽類(lèi)卵泡發(fā)育成熟的過(guò)程中具有優(yōu)先等級(jí)的特點(diǎn)，即卵泡從小到大按排卵次序排列。雞的卵泡一般按直徑大小分類(lèi)，等級(jí)前卵泡可分為:小白卵泡(SWF，＜2mm)、大白卵泡(LWF，3~5mm)、小黃卵泡(SYF，6~8mm)和大黃卵泡(LYF，9~12mm)。由于卵泡膜都非常薄，所以通過(guò)顯微外科手術(shù)獲得完整的不同大小的黃、白卵泡，在技術(shù)上要求較高。 1.3.3總RNA的提取 (1) 在分別裝有大小黃白卵泡的1.5 mL EP管內(nèi)加入300 mL Trizol，

21、不停吹打直至細(xì)胞充分裂解，固形物消失，室溫靜置5 min。 (2) 向上一步的細(xì)胞裂解液中加1/5體積量Trizol的氯仿，蓋緊離心管蓋，用手劇烈振蕩15 s。待溶液充分乳化后，室溫靜置5 min。 (3) 12,000 g，4 ℃離心15 min。 (4) 從離心機(jī)中小心取出離心管，此時(shí)勻漿液分為三層：無(wú)色的上清液、中間的白色蛋白層及下層帶有顏色的有機(jī)相。吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中。 (5) 向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒充分混勻后，在15 ~ 30 ℃下靜置10 min。 (6) 12,000 g ,4 ℃離心10 min。 (7) 小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁

22、加入75%的乙醇l mL (勿觸及沉淀)，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12,000 g，4 ℃離心5 min后小心棄去乙醇。 (8) 室溫干燥沉淀2 ~ 5 min，加入30 mL RNase Free水溶解沉淀，用移液槍輕輕吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80 ℃保存。 1.3.4總RNA完整性鑒定 （1）OD260/OD280比值測(cè)定：經(jīng)微量核酸蛋白測(cè)定儀OD260/OD280比值在1.8 ~ 2.0之間。初步確定樣品Total RNA完整性較好。 （2）大小黃白卵泡Total RNA電泳：取50 mL RNase Free加入1 mL 50 × TAE Buffer，0.5

23、g 瓊脂糖，煮沸，稍涼后加入兩滴EB，凝固，制成1% RNA電泳用膠。將RNA專(zhuān)用電泳槽用固相RNase清除劑工作液處理5 min以上，加入無(wú)RNase的TAE工作液。Total RNA 5mL與1mL Loading Buffer混合后點(diǎn)樣。電壓200V以上，電泳十分鐘左右。 經(jīng)電泳檢測(cè)，total RNA的28S、18S和5S三條帶可見(jiàn)，證明total RNA完整性良好。28S、18S、5S分別具有4700、1900、120個(gè)核苷酸。 1.3.5 總RNA內(nèi)基因組DNA的去除 使用PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒。 試劑

24、添加：2 mL 的5×gDNA Eraser Buffer；1 mL的gDNA Eraser；﹤1 mg的Total RNA；加RNase Free dH2O至總量為10 mL 。 反應(yīng)條件：42 ℃ 2 min 4 ℃ ∞ 1.3.6反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 使用Takara公司PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒。 試劑添加：4 mL的5×PrimeScript? Buffer 2，1 mL的Pr

25、imeScript? RT Enzyme Mix I；1 mL的RT Primer Mix；10 mL去除基因組DNA后的Total RNA，加RNase Free dH2O至總量為 20 mL。 1.3.7 PCR反應(yīng) 使用天根公司Taq DNA Polymerase(含10×Taq Buffer)、dNTP Mixture。 試劑添加：1 mL 的Forward Primer；1 mL的Reverse Primer；2 mL的10×Taq Buffer；1.6 mL的dNTP Mixture，0.4 mL的Taq DNA Polymerase；2 mL的cDNA；1.5 mL的MgC

26、l2；加H2O至總量為20 uL。 反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min 94 ℃ 5 s 60 ℃ 30 s 35 循環(huán) 72 ℃ 30 s 72 ℃ 2 min 1.3.8 電泳檢測(cè) 50mL 蒸餾水加入1 mL 50 × TAE Buffer，0.5 g 瓊脂糖，煮沸，稍涼后加入2滴EB，凝固，制成

27、1% DNA電泳用膠。5 mL PCR產(chǎn)物與1 mL Loading Buffer混合后點(diǎn)樣。電壓130 V，電泳30 min。 1.3.9 PCR產(chǎn)物純化 用100 mL PCR產(chǎn)物電泳后，進(jìn)行膠回收。步驟如下： (1) 在紫外燈下將目的條帶切下，切碎后稱(chēng)重。1 mg = 1 mL計(jì)算膠塊體積。 (2) 向膠塊中加入膠塊融化液DR-I Buffer。1%濃度的膠加入3個(gè)凝膠體積量的DR-I Buffer；1% ~ 1.5%的膠加4個(gè)凝膠體積量；1.5% ~ 2%的膠加5個(gè)凝膠體積量。 (3) 均勻混合后75 ℃加熱融化膠塊。此時(shí)應(yīng)間斷振蕩混合6 ~ 10 min，使膠塊充分融化。

28、 (4) 向上述膠塊融化液中加入DR-I Buffer量的1/2體積量的DR-II Buffer，均勻混合。當(dāng)分離小于400 bp的DNA片段時(shí)，應(yīng)在此溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。 (5) 將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。將上述操作4的溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12,000 rpm離心1 min，棄濾液。將濾液再加入Spin Column中離心一次，以提高DNA的回收率。 (6) 將500 mL的Rinse A加入Spin Column中，12,000 rpm離心30 s，棄濾液。 (7) 將700 mL的Rinse B (預(yù)先

29、加入制定體積的無(wú)水乙醇) 加入Spin Column中，12,000 rpm離心30 s，棄濾液。 (8) 重復(fù)操作步驟7。 (9) 將Spin Column安置于Collection Tube上，12,000 rpm離心1 min。 (10) 將Spin Column安置于新的1.5 mL的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入25 mL的60 ℃滅菌蒸餾水或60 ℃ Elution Buffer，室溫靜置1 min。 (11) 12,000 rpm離心1min洗脫DNA。 (12) 純化后的PCR產(chǎn)物存放于﹣20 ℃?zhèn)溆谩? 1.3.10 連接轉(zhuǎn)化 使用Takara公

30、司的pMD?19-T Vector試劑盒與Takara公司的感受態(tài)大腸桿菌DH5α。所有操作在冰上進(jìn)行，操作步驟如下： (1) 在微量離心管中配制下列DNA溶液：1 mL 的pMD?19-T Vector；0.1 pmol ~ 0.3 pmol的 Insert DNA；加dH2O至總量為5 μL。 (2) 加入5 μL(等量)的Solution I。 (3) 16 ℃反應(yīng)30 min。 (4) 全量 (10 μL)加入至100 μL感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，冰中放置30 min。 (5) 42 ℃加熱約1min，再在冰中放置約2 min。 (6) 加入約1mL無(wú)抗的SOC培養(yǎng)基，3

31、7 ℃振蕩培養(yǎng)60 min，使大腸桿菌復(fù)蘇。 (7) 取約200 μL復(fù)蘇后的大腸桿菌涂在含X-Gal、IPTG、Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)約12 h。 (8) 將長(zhǎng)出菌落的培養(yǎng)板放4 ℃約一天時(shí)間，讓藍(lán)色菌落充分顯色。 (9) 挑取白色單克隆菌落在SOC培養(yǎng)基中37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)12 h。 (10) 送交菌液去華大公司測(cè)序。 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)論 2.1 雞卵泡顆粒細(xì)胞 在促性腺激素等作用的調(diào)控下，卵泡中顆粒細(xì)胞增殖分化。顆粒細(xì)胞合成多種激素及生長(zhǎng)因子，并表達(dá)其受體，通過(guò)間隙連接調(diào)控卵泡膜細(xì)胞和卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)分化和成熟，進(jìn)而調(diào)控卵泡的發(fā)育。顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)分化可以作為卵泡發(fā)育的

32、標(biāo)志。試驗(yàn)中觀察到的卵泡顆粒細(xì)胞如圖1所示。 圖1 雞卵泡顆粒細(xì)胞 （上圖為40倍鏡觀察，下圖為100倍鏡觀察） 2.2 總RNA的檢測(cè)結(jié)果 為了檢測(cè) RNA 的完整性、含量和純度，吸取從卵泡顆粒細(xì)胞中所提取的總 RNA 5μL，用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢查，結(jié)果有清晰的、無(wú)拖尾的兩條帶（圖1），即 5.8 SrRNA 、18SrRNA 和 28SrRNA，說(shuō)明樣品 RNA 是完整的。用核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定結(jié)果顯示，RNA樣品的OD260與OD280比值均在1.8～2.0之間。帶與帶之間無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象，表明RNA樣品無(wú)降解，無(wú)明顯的DNA、蛋白質(zhì)、酚等污染，可用于下一步研究使用。

33、 圖2 總 RNA 的檢測(cè) 2.3 PCR檢測(cè) 圖3 PCR產(chǎn)物檢測(cè) 3.分析討論 目前我國(guó)蛋雞養(yǎng)殖量居全球第一，數(shù)據(jù)顯示，商品蛋雞的飼養(yǎng)量估計(jì)在15億只左右。在生產(chǎn)性能能正常發(fā)揮的狀態(tài)下，12億商品蛋雞所生產(chǎn)的雞蛋可以滿足國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的需求。近年來(lái)受疾病的影響，產(chǎn)蛋水平參差不齊，雞蛋價(jià)格仍不穩(wěn)定。據(jù)統(tǒng)計(jì)，蛋雞產(chǎn)業(yè)從業(yè)人員約為1000萬(wàn)人左右，包括孵化、雛雞、雞蛋、蛋品加工、淘汰雞在內(nèi)的蛋雞業(yè)年產(chǎn)值突破1500億元。為其服務(wù)的飼料、獸藥和疫苗、設(shè)備制造業(yè)等相關(guān)產(chǎn)業(yè)跟進(jìn)快速發(fā)展，增加了社會(huì)從業(yè)人員的就業(yè)渠道和就業(yè)機(jī)會(huì)。資料顯示，2011年種雞、蛋

34、雞、雞蛋零售、飼料、獸藥、疫苗相關(guān)產(chǎn)業(yè)年產(chǎn)值超過(guò)了3500億元。據(jù)有關(guān)統(tǒng)計(jì)。目前我國(guó)的雞場(chǎng)數(shù)量分布如下：蛋雞祖代場(chǎng)27家、國(guó)內(nèi)蛋雞育種場(chǎng)3～4家、父母代蛋種雞場(chǎng)1200多家、商品代蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)30多萬(wàn)家、蛋品加工企業(yè)500多家、國(guó)家級(jí)龍頭企業(yè)7家。 可見(jiàn)，提高蛋雞單產(chǎn)量、降低料蛋比可顯著提高我國(guó)蛋雞養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)提高蛋雞產(chǎn)蛋量、降低料蛋比的研究主要集中在以下幾個(gè)方面： （1）選擇輕型蛋雞 實(shí)踐表明，產(chǎn)蛋量相同的母雞，體重每增加0.25公斤，每年約多耗料3公斤。 　?。?）科學(xué)配制日糧 飼料原料要新鮮無(wú)霉變，豆類(lèi)制品要經(jīng)高溫去毒處理。氣溫高時(shí)應(yīng)提高日糧中蛋白質(zhì)的含量，

35、天冷時(shí)適當(dāng)增加能量飼料。蛋雞產(chǎn)蛋初期飼料中的蛋白質(zhì)含量應(yīng)稍高于飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)蛋高峰期應(yīng)將日糧中蛋白質(zhì)的含量提高到19％。最好將飼料加工成直徑0.5厘米的顆粒料，以利于提高飼料的適口性，減少浪費(fèi)。 　?。?）精心飼喂 據(jù)飼養(yǎng)實(shí)踐，添加飼料時(shí)要做到少量多次，每次加料不宜超過(guò)料槽的1/3。同時(shí)要供給充足潔凈的飲水，補(bǔ)喂優(yōu)質(zhì)新鮮的青綠多汁飼料。另外，要給蛋雞提供直徑4-5mm的砂粒，讓雞自由采食，以利于食物消化。一般以產(chǎn)蛋高峰為界（40周齡左右），前期限喂量宜小，后期限喂量宜大，控制飼料用量6％-10％。 （4）添加添加劑 在日糧加入油脂、維生素C、色氨酸，可提高蛋雞產(chǎn)蛋率。 （5）科學(xué)管理

36、 雞產(chǎn)蛋前的適宜溫度、濕度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致飼料利用率、產(chǎn)蛋量下降，蛋雞可采用間隙光照，每天16h，光照強(qiáng)度以雞能看見(jiàn)覓食為準(zhǔn)。同時(shí)注意飼養(yǎng)密度要；注意雞舍衛(wèi)生，嚴(yán)格消毒，每2個(gè)月給雞群驅(qū)1次蟲(chóng)，搞好疫病的免疫接種工作，禁止濫用藥物。經(jīng)常觀察雞群，發(fā)現(xiàn)病雞及時(shí)隔離診治。 （6）強(qiáng)制換羽 當(dāng)?shù)半u產(chǎn)蛋量下降50％時(shí)，可采取人工手段使雞體重下降30％，讓蛋雞在短時(shí)間內(nèi)換羽，經(jīng)過(guò)40-50d，產(chǎn)蛋量可恢復(fù)60％，進(jìn)入第2個(gè)產(chǎn)蛋期。另外，在日糧中添加2.5％氧化鋅，可促進(jìn)蛋雞換羽，縮短換羽時(shí)間，促其提前產(chǎn)蛋。 以上措施在一定程度上能提高蛋雞產(chǎn)蛋量，但這些措施實(shí)際上都屬于蛋雞養(yǎng)殖業(yè)管理層面上，未能從

37、根本上改善蛋雞養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。因此，提高蛋雞養(yǎng)殖利潤(rùn)的有效措施就是從根本上提高蛋雞產(chǎn)蛋量，降低料蛋比。 4.參考文獻(xiàn) [1] 楊玉,黃應(yīng)祥,曹果青,張桂賢,楊文平. 能量對(duì)蛋雞卵巢促卵泡素受體mRNA表達(dá)及產(chǎn)蛋率的影響[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào). 2009(04) [2] 倪迎冬,周玉傳,盧立志,陳杰,趙茹茜. 紹興鴨性成熟前卵巢GnRH-I與ER-βmRNA表達(dá)的發(fā)育性變化[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2004(06) [3] 周玉傳,傅啟高,趙茹茜,倪迎冬,陳杰. EGH受

38、體、IGF-I型受體、FSH受體和LH受體mRNA在紹鴨各級(jí)卵泡顆粒層和膜層中的表達(dá)[J]. 遺傳學(xué)報(bào). 2003(09) [4] 雷雪芹,陳宏,袁志發(fā),雷初朝,徐廷生,孫維斌. 促卵泡生成素受體基因的SNP對(duì)牛雙胎性狀的標(biāo)記研究[J]. 云南畜牧獸醫(yī). 2002(04) [5] 傅衍,牛冬,阮暉,余旭平,陳功,何國(guó)慶. 活化素和卵泡抑素對(duì)紹鴨卵泡顆粒細(xì)胞FSH受體mRNA表達(dá)作用的研究[J]. 遺傳學(xué)報(bào). 2001(12) [6] 張才喬. 鵪鶉卵泡發(fā)育過(guò)程中顆粒細(xì)胞黃體生成素受體mRNA的表達(dá)[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2000(01) [7] 張寧波. 雞繁殖性狀相關(guān)基因及

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