白細胞抗原檢測,1,.,目 錄,第一節(jié) HLA血清學檢測 HLA抗原檢測 HLA抗體檢測 第二節(jié) HLA細胞學檢測 第三節(jié) HLA分子生物學檢測 HLA的分子生物學檢測方法 HLA常見基因分型方法比較 HLA分型模棱兩可結(jié)果的原因及其對策 第四節(jié) 粒細胞抗原抗體檢測,2,.,第一節(jié) HLA血清學檢測,3,.,重點提示,HLA抗原檢測 掌握微量淋巴細胞毒實驗的原理及其影響因素 HLA抗體檢測方法 淋巴細胞毒方法 流式細胞儀方法 ELISA方法 Luminex檢測技術(shù) 掌握不同方法的原理及其優(yōu)缺點,4,微量淋巴細胞毒試驗,HLA抗原的血清學分型方法 用一系列已知的抗HLA標準分型血清來檢測未知淋巴細胞表面的HLA抗原型別 微量淋巴細胞毒實驗原理 基于抗原抗體反應(yīng) 抗原抗體免疫復(fù)合物在補體的作用破壞細胞膜 利用染料或其它方法鑒定和區(qū)分死活細胞 計分法：NIH計分法,5,.,HLA抗血清的來源,HLA抗體血清來源 同種免疫刺激產(chǎn)生HLA同種抗體 HLA抗原免疫刺激動物 雜交瘤技術(shù) 人群存在的天然抗體,6,.,微量淋巴細胞毒試驗的影響因素,HLA抗血清 抗血清來源和抗體種類、抗血清效價、抗血清特性、抗血清質(zhì)量 淋巴細胞 淋巴細胞活性 、淋巴細胞純度、淋巴細胞數(shù)量、淋巴細胞上抗原表達異常 孵育時間和溫度 補體活性 染色和固定時間,7,.,血清學抗原分型方法評價,血清學方法抗原分型 檢測HLA-類和類抗原 檢測HLA-類抗原相對容易 檢測HLA-類抗原需要分離和純化淋巴細胞 易受多種因素影響 其錯誤率相對較高 HLA血清學某一座位上只能檢測到一個抗原，而基因分型存在兩個不同等位基因，應(yīng)考慮到無效等位基因,8,.,HLA抗體檢測,補體依賴的淋巴細胞毒方法（CDC） 采用淋巴細胞作為靶細胞抗原 易受多種因素影響，檢測敏感性最低 ELISA 方法 ELISA方法能檢測HLA-I和HLA-II抗體 流式細胞術(shù) 采用淋巴細胞作為靶細胞抗原 結(jié)合熒光檢測技術(shù)特點 Luminex檢測技術(shù) 結(jié)合熒光流式細胞儀和免疫標記技術(shù) 可區(qū)分HLA-I和HLA-II抗體 可鑒定抗體的屬性和強度,9,.,HLA抗體檢測,Luminex檢測技術(shù) 以包被抗原的微球磁珠作為靶細胞 每種磁珠上包被一種抗原 多種磁珠可以在同一體系內(nèi)反應(yīng) 待測血清與磁珠孵育 存在HLA抗體時，形成抗原-抗體復(fù)合物 加入熒光標記的抗人IgG抗體 形成抗原-抗體-熒光標記抗體復(fù)合物 Luminex儀測定微球磁珠上的熒光值 判定HLA抗體的強度和特異性 微球磁珠熒光值大小 每種磁珠的反應(yīng)特性,10,.,第二節(jié) HLA細胞學檢測,11,.,重點提示,掌握下列方法的基本原理及其應(yīng)用 混合細胞培養(yǎng)方法（mixed lymphocyte culture，MLC） 純合分型細胞（homozygote typing cell,HTC） 預(yù)致敏淋巴細胞試驗（primed lymphocyte test,PLT）,12,.,混合淋巴細胞培養(yǎng),混合淋巴細胞培養(yǎng)（MLC） 二個無關(guān)個體的淋巴細胞在體外混合一起培養(yǎng) 二者組織相容性抗原不同，互相刺激對方的T細胞發(fā)生增殖 增殖反應(yīng)強度與組織相容性抗原的差異程度成正比 轉(zhuǎn)化的淋巴母細胞表現(xiàn)為細胞體積增大、核內(nèi)DNA和RNA合成增加 MLC 用于HLA-D抗原分型 實體器官移植前的快速相容性檢測 分為雙向MLC和單向MLC,13,.,混合淋巴細胞培養(yǎng),雙向MLC 雙方的淋巴細胞互相刺激而增生、轉(zhuǎn)化，即雙方的淋巴細胞既是刺激細胞，又是反應(yīng)細胞 抗原相同或相容，則刺激作用很小，細胞無變化 抗原不相容，則刺激作用大，細胞被活化并產(chǎn)生增殖 單向MLC 一方的淋巴細胞用X線照射或用絲裂霉素C處理 喪失增殖反應(yīng)能力而仍保留其抗原刺激效應(yīng) MLC只有一方淋巴細胞發(fā)生增殖反應(yīng)，故可了解單一個體淋巴細胞的刺激強度和應(yīng)答程度,14,.,純合細胞分型方法,純合細胞分型方法（也稱為陰性分型） 已知HLA-Dw型別的經(jīng)滅活的純合子細胞作為刺激細胞 待檢細胞作為反應(yīng)細胞 兩種細胞進行單向混合淋巴細胞培養(yǎng) 若不發(fā)生或僅發(fā)生弱的增殖反應(yīng) 表明受檢細胞具有與純合子分型細胞相同的HLA-Dw型別，它可能為特定HLA-Dw型的純合子或雜合子 發(fā)生增殖反應(yīng) 表明受檢細胞不具有純合子細胞擁有的HLA-Dw型別,15,.,預(yù)致敏淋巴細胞（PL）,預(yù)致敏淋巴細胞（PL） 僅對一種單體型具有識別增殖能力，而處于靜止狀態(tài)的小淋巴細胞 作為應(yīng)答細胞參與了初次MLC反應(yīng)，經(jīng)過增殖后又回到小淋巴細胞 遇到相應(yīng)抗原刺激后，迅速發(fā)生淋巴細胞轉(zhuǎn)化和增殖,16,.,預(yù)致敏淋巴細胞試驗,預(yù)致敏淋巴細胞試驗（又稱為陽性分型法) PL細胞作為已知的分型細胞 待檢淋巴細胞作為刺激細胞 待檢淋巴細胞分別與一系列的預(yù)致敏淋巴細胞進行單向MLC 待檢細胞與預(yù)致敏淋巴細胞預(yù)先識別的抗原相同，預(yù)致敏淋巴細胞會迅速增殖 預(yù)致敏淋巴細胞分型試驗是用陽性反應(yīng)作為判定標準,17,.,第三節(jié) HLA分子生物學檢測,18,.,重點提示,HLA的分子生物學檢測方法 掌握PCR-SSP、PCR-SSO、Luminex檢測技術(shù)、基因芯片、PCR-SBT的基本原理 掌握HLA常見基因分型方法的特點及其適用范圍 HLA高分辨分型中模棱兩可結(jié)果的原因及其對策 明確其形成原因 掌握4種常見方法的原理及其應(yīng)用,19,.,HLA分子生物學檢測,HLA基因分型技術(shù)主要方法 PCR序列特異性引物（PCR sequence specific primer, PCR-SSP） PCR序列特異性寡核苷酸探針技術(shù)（PCR sequence specific oligonucleotide probe, PCR-SSO） Luminex檢測技術(shù) 基因芯片 核苷酸序列測定法（PCR sequence based-typing，PCR-SBT）,20,.,PCR序列特異性引物,PCR序列特異性引物（PCR-SSP） 根據(jù)HLA等位基因核苷酸堿基序列的差異性，設(shè)計出一系列特異性引物 引物3端最后一個堿基是否與其等位基因DNA模板配對起決定作用 根據(jù)多對引物擴增的結(jié)果可以指定HLA基因型 方法操作簡單，快速耗時較短，結(jié)果判斷簡便 有低分辨和高分辨分型試劑，為實驗室常用的方法之一 可能出現(xiàn)假陽性帶或漏帶現(xiàn)象 某些罕見的HLA等位基因存在錯誤結(jié)果,21,.,PCR序列特異性寡核苷酸探針,PCR序列特異性寡核苷酸探針(PCR-SSO) 利用核酸互補的雜交技術(shù) 特異性引物擴增目的DNA片段 PCR擴增產(chǎn)物與特異性探針進行雜交 酶促反應(yīng)體系或顯色（影）溶液進行顯色 無顏色顯示 基因片段與探針不互補 顯示顏色 基因片段與探針互補 根據(jù)多個探針雜交信號結(jié)果進行HLA分型指定,22,.,Luminex檢測技術(shù),Luminex檢測技術(shù) 原理是利用核酸互補的雜交技術(shù) 每一種微球上只固定一種已知序列的特異性探針 利用特異性引物擴增目的DNA片段 PCR擴增產(chǎn)物與多種微球在同一孔內(nèi)進行特異性雜交 雜交后加入熒光顯色劑 Luminex檢測儀綠色激光束檢測雜交信號 Luminex檢測儀紅色激光束區(qū)分探針的種類 擴增基因片段與探針不互補，在微球上無熒光顯示 擴增基因片段與探針互補，在微球上有熒光顯示 根據(jù)熒光值強度大小可以判定待測片段是否與探針互補,23,.,基因芯片技術(shù),基因芯片技術(shù) 技術(shù)原理是根據(jù)核酸互補的雜交技術(shù)，并結(jié)合激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)特性 在特定載體（玻璃、硅等）上高密度有序地排列特定寡核苷酸片段作為探針 對待檢標本HLA基因片段進行擴增并熒光標記 將待測標記的HLA基因片段與特定探針進行雜交 基因片段與探針不互補，該探針位置無熒光顯示 基因片段與探針互補，該探針位置可顯示熒光 通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)對芯片進行掃描，根據(jù)熒光值強度大小可以判定待測片段是否與探針互補,24,.,核苷酸序列測定法,核苷酸序列測定法（PCR-SBT） 擴增目的DNA片段 對擴增片段進行測序分析 指定HLA等位基因型別 根據(jù)測序序列中核苷酸多態(tài)性位點堿基情況，與已知可能的等位基因的序列進行比較 直接檢測基因的核苷酸序列 屬于高分辨方法，結(jié)果準確性最高 直接雙鏈測序過程中存在模棱兩可基因型結(jié)果,25,.,新一代測序技術(shù),新一代測序（NGS）技術(shù) 市場上有多種技術(shù)平臺，其測序原理上存在差異 NGS已應(yīng)用于HLA分型 其關(guān)鍵在于如何系統(tǒng)建立好HLA位點的DNA文庫 片段擴增和測序步驟則取決于所用的技術(shù)平臺 應(yīng)用于HLA-I和HLA-II位點分型 單鏈測序結(jié)果 NGS進行HLA分型存在一定的偏差,26,.,HLA常見基因分型方法比較,27,.,模棱兩可結(jié)果產(chǎn)生的原因,PCR-SSP的模棱兩可結(jié)果 PCR-SSP方法針對同一座位上不同等位基因堿基多態(tài)性位點設(shè)計引物 引物可特異性針對單一或多個等位基因 只擴增某特定的單一等位基因 可直接指定特定單一等位基因 引物對常擴增HLA某一座位數(shù)個等位基因 存在多種可能性 PCR-SSP方法可產(chǎn)生一定的模棱兩可分型結(jié)果 采用不同引物對的組合方式來指定或排除某個等位基因 等位基因數(shù)量較多而且引物大多針對多個等位基因,28,.,模棱兩可結(jié)果產(chǎn)生的原因,PCR-SSO的模棱兩可結(jié)果 探針的序列決定其特異性 部分探針只與某一等位基因序列互補雜交 標本與該探針雜交可明確無誤地指定相應(yīng)特定等位基因 絕大多數(shù)探針能夠與多種等位基因序列互補雜交 無法單純依靠這種探針進行等位基因指定 探針反應(yīng)格局表通過數(shù)理邏輯關(guān)系指定HLA基因型 大量探針往往針對多個等位基因，錯綜復(fù)雜的雜交格局，導致產(chǎn)生模棱兩可的分型結(jié)果,29,.,模棱兩可結(jié)果產(chǎn)生的原因,PCR-SBT的模棱兩可結(jié)果 雙鏈測序反應(yīng)得到的序列是兩個等位基因序列的組合 測序獲得的序列與多種等位基因的組合序列完全匹配 有三種情況可能引起模棱兩可的結(jié)果 測序區(qū)域未包括這些等位基因核苷酸的區(qū)分點 A*74:01和A*74:02僅在第1號外顯子存在差別(第67位) 大多數(shù)等位基因未測定全部外顯子序列 HLA-A*02:08、HLA-A*03:06缺乏第4外顯子序列 多種等位基因組合在測序區(qū)域內(nèi)具有相同的雜合序列 DRB1*03:01:01G+DRB1*13:32、DRB1*03:06+DRB1*13:93和DRB1*03:12+DRB1* 13:40的組合在2號外顯子表現(xiàn)為完全相同的雜合序列,30,.,模棱兩可結(jié)果區(qū)分的策略,模棱兩可結(jié)果區(qū)分的方法 常見及確認等位基因原則（Common alleles and well documented alleles，CWD） 結(jié)合多種方法結(jié)果進行綜合判斷 改用其它廠家的試劑 增加測序的范圍或雜交的探針數(shù) 采用單鏈DNA抽提技術(shù) 采用單鏈擴增技術(shù) 采用組特異性測序引物技術(shù) 克隆轉(zhuǎn)染后形成單鏈后檢測,31,.,CWD原則,HLA等位基因定義為三大類 常見等位基因（Common alleles） 指那些在參考群體中頻率大于0.001的等位基因 確認等位基因（Well-documented alleles） 至少在五個獨立非親緣個體中或者三個獨立非親緣個體中并伴有特定的單體型被檢測到的等位基因 罕見等位基因（Rare alleles) 除常見等位基因和確認等位基因以外的所有等位基因 它們的頻率很低,32,.,CWD原則,CWD原則 CWD原則分型中將常見等位基因和確認等位基因合并為CWD,當模棱兩可的等位基因組合中出現(xiàn)CWD等位基因可能需要進一步區(qū)分，而出現(xiàn)罕見等位基因組合，其臨床分型中實際意義有限，可予以排除,33,.,單鏈DNA抽提技術(shù),單鏈DNA抽提技術(shù)將個體兩個等位基因進行分離 根據(jù)等位基因序列設(shè)計生物素標記的特異性探針（僅與某一等位基因互補） 探針與標本基因組DNA進行雜交反應(yīng) 雜交后將形成單一等位基因DNA/特異性探針復(fù)合物 加入鏈親和素標記磁珠，將形成單一等位基因DNA/特異性探針/磁珠復(fù)合物 洗滌后溶液中只含有單一等位基因DNA/特異性探針/磁珠復(fù)合物,34,.,單鏈DNA抽提技術(shù),單鏈分離技術(shù) 探針結(jié)合雜交互補 選擇性獲取單體型 商業(yè)產(chǎn)品 HLA-C*01:02 Biotin-CTC CAT gAA gTA TTT CTT CA,圖為單鏈抽提C*01:02后測序的一段序列,35,.,單鏈擴增技術(shù),該技術(shù)原理類似于PCR-SSP 選擇合適的引物只擴增個體兩個等位基因的特定等位基因 比對序列 設(shè)計特異性引物 重點在于引物序列 TGGCGCCCCGAACCCTCG,圖為單鏈擴增A*24:02后測序的一段序列,36,.,組特異性測序引物技術(shù),該技術(shù)原理利用特異性引物進行測序反應(yīng) 在測序過程中設(shè)計特異性的測序引物 該引物只能與某一個等位基因的序列互補 該引物測序?qū)⒌玫脚c引物序列互補的某個特定等位基因的序列 A-98T CACTCCATGAGGTATTTCTT A-98A CACTCCATGAGGTATTTCTA,圖為A*02:01,11:01用特異性引物測序后的比較,37,.,第四節(jié) 粒細胞抗原抗體檢測,38,.,重點提示,掌握粒細胞抗原、抗體檢測血清學診斷方法的原理 粒細胞凝集試驗 粒細胞免疫熒光試驗 流式細胞技術(shù) 單克隆抗體粒細胞抗原捕獲試驗 ELISA方法 掌握HNA系統(tǒng)基因分型技術(shù)原理及其適應(yīng)范圍 PCR限制性片段長度多態(tài)性 PCR序列特異性引物 PCR直接測序法 多重SNaPshot 技術(shù),39,.,粒細胞抗原、抗體檢測診斷方法,粒細胞凝集試驗（GAT方法） 分離新鮮的粒細胞 在Terasaki微量板上進行實驗 待測粒細胞與標準抗血清反應(yīng)后或標準粒細胞與待檢血清反應(yīng)后在顯微鏡下觀察粒細胞凝集情況 依據(jù)細胞凝集情況來判定抗原或抗體的特性 早期建立的方法，操作簡單 方法靈敏度、特異性都不高 HLA抗體和某些高滴度的免疫復(fù)合物會導致假陽性結(jié)果,40,.,粒細胞抗原、抗體檢測診斷方法,粒細胞免疫熒光試驗（GIFT） 直接法用于檢測粒細胞抗原 熒光標記的粒細胞抗體與待檢粒細胞反應(yīng) 有相應(yīng)的抗原存在時可形成抗原抗體反應(yīng) 通過熒光顯微鏡檢測熒光的情況 間接法用于檢測粒細胞抗體或抗原 分離出新鮮的粒細胞與待檢血清反應(yīng) 存在相應(yīng)抗體時可形成抗原抗體結(jié)合物 洗滌后加入熒光標記的抗人IgG反應(yīng)，繼續(xù)形成抗原-抗體-熒光標記抗人IgG結(jié)合物，洗滌后通過熒光顯微鏡檢測熒光的情況 敏感性、特異性均優(yōu)于GAT法 需要熒光顯微鏡，實驗干擾因素較多,41,.,粒細胞抗原、抗體檢測診斷方法,流式細胞技術(shù) 檢測粒細胞抗原或抗體 以抗體檢測為例闡述其原理 將粒細胞與待檢血清進行反應(yīng) 存在相應(yīng)抗體時可形成抗原抗體結(jié)合物 洗滌后加入熒光標記的抗人IgG-Fc、IgM-Fc 繼續(xù)形成抗原-待檢抗體-熒光標記抗人Ig結(jié)合物 通過流式細胞計數(shù)儀檢測熒光的情況 該方法敏感性、特異性較好,42,.,粒細胞抗原、抗體檢測診斷方法,單克隆抗體粒細胞抗原捕獲試驗( MAIGA方法) 粒細胞與待檢血清反應(yīng)，存在相應(yīng)抗體可形成抗原抗體復(fù)合物 加入特定的單克隆抗體，形成單克隆抗體-抗原-抗體三聯(lián)復(fù)合物 細胞裂解離心獲取上清液（含三聯(lián)復(fù)合物），將其加入到包被特定抗體的ELISA板微孔內(nèi)反應(yīng)，可形成包被抗體-單克隆抗體-粒細胞抗原-待測抗體復(fù)合物 洗滌后加入酶標記的抗人IgG抗體形成包被抗體-單克隆抗體-粒細胞抗原-待測抗體-酶標抗體復(fù)合物 顯色劑比色分析，根據(jù)顯色程度判定抗體情況,43,.,粒細胞抗原、抗體檢測診斷方法,ELISA方法 特異性單克隆抗體包被的微板 加入粒細胞抗原和待檢血清反應(yīng) 存在相應(yīng)抗體可形成包被抗體-抗原-待測抗體復(fù)合物 加入酶標記的抗人IgG形成包被抗體-抗原-待測抗體-酶標抗體復(fù)合物 加顯色劑進行比色分析 根據(jù)顯色程度判斷抗體的有無和強度 ELISA方法敏感性和特異性較好,44,.,HNA系統(tǒng)基因分型技術(shù),PCR限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP) PCR擴增目的DNA片段，產(chǎn)物采用合適的限制性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，電泳后進行分辨 HNA不同等位基因的酶切圖譜不同 PCR-RFLP方法簡便，分型時間較短 已成功用于HNA-4a 和-5a的分型 PCR序列特異性引物（PCR-SSP） 根據(jù)HNA系統(tǒng)等位基因核苷酸堿基序列差異性設(shè)計引物 引物3端堿基與等位基因的特異性堿基相匹配 根據(jù)PCR 產(chǎn)物的有無進行等位基因的分型 實驗室最常用的分子診斷方法 文獻報道HNA-1、-3、-4和-5系統(tǒng)基因分型的PCR-SSP方法,45,.,HNA系統(tǒng)基因分型技術(shù),PCR直接測序法（PCR-SBT） PCR擴增HNA系統(tǒng)目的DNA片段 利用雙脫氧測序方法對擴增片段進行測序分析 根據(jù)測序序列指定HNA等位基因 PCR-SBT 分型結(jié)果準確，可以識別新的突變點 已應(yīng)用于HNA-1、-3、-4和-5系統(tǒng)基因分型 多重SNaPshot技術(shù) 單堿基延伸原理為基礎(chǔ)，利用多重PCR對多個SNP 位點進行分型 SNaPshot為中等通量SNP分型技術(shù) 檢測費用較PCR-SBT明顯降低 在同一體系中檢測HNA-1、-3、-4和-5系統(tǒng)等位基因,46,.,本章小結(jié),HLA分型技術(shù)有血清學方法、細胞學方法和基因分型方法 血清學方法常見為微量淋巴細胞毒試驗 易受抗血清、淋巴細胞、反應(yīng)溫度和時間、補體和判定等影響 細胞學分型方法主要包括混合淋巴細胞培養(yǎng)法、純合分型細胞試驗和預(yù)致敏淋巴細胞試驗 基因分型方法 檢測其基因堿基核苷酸多態(tài)性情況 常見的方法為PCR-SSP、PCR-SSO、Luminex技術(shù)、PCR-SBT、基因芯片 存在模棱兩可基因型結(jié)果，有多種解決方法 CWD指定原則、組特異性測序引物技術(shù)和單鏈擴增技術(shù),47,.,本章小結(jié),HLA抗體檢測常見的方法為淋巴細胞毒方法、流式細胞儀方法、ELISA方法、Luminex檢測技術(shù) 粒細胞抗原或抗體血清學方法主要有粒細胞凝集試驗、粒細胞免疫熒光試驗、單克隆抗體粒細胞抗原捕獲試驗、流式細胞技術(shù)和ELISA等 粒細胞抗原系統(tǒng)基因分型方法常見為PCR-RFLP、PCR-SSP、PCR-SBT和多重SNaPshot,48,.,Thank you !,49,.,