《2015RB048轉(zhuǎn)基因檢測方法證實(shí)評價(jià)指南--草案（征求意見稿）》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《2015RB048轉(zhuǎn)基因檢測方法證實(shí)評價(jià)指南--草案（征求意見稿）（19頁珍藏版）》請?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

發(fā)  布擊此處添加   點(diǎn)擊此處添加中國標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)分類號  華人民共和國認(rèn)證認(rèn)可行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)   基因檢測方法 驗(yàn)證 評價(jià)指南  on of MO  4790  （ 草案 ）    布    施  中  華  人  民  共  和  國  國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局  目    次    前     言 .......................................................................................................................................基因檢測方法 驗(yàn)證 評價(jià)指南 ................................................................................................... 范圍 ........................................................................................................................................... 規(guī)范性引用文件 ....................................................................................................................... 術(shù)語和定義 ............................................................................................................................... 符號和縮略語 ........................................................................................................................... 轉(zhuǎn)基因檢測方法 驗(yàn)證 評價(jià) .......................................................................................................錄 A （資料性附錄）  量對實(shí)際 影響  ...................................................... 11 附錄 B （資料性附錄）  對 取方法的評價(jià)（抑制試驗(yàn)）  ......................................錄 C （資料性附錄）  中間濃度 陽 性 對照 的生產(chǎn)  .............................................................錄 D （資料性附錄）  基于實(shí)時(shí) 轉(zhuǎn)基因含量平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差的評估 .................................................................................................................     言  本標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù) 準(zhǔn)化工作導(dǎo)則  第 1 部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》中的要求進(jìn)行編寫的。  本標(biāo)準(zhǔn)等同采用歐盟委員會聯(lián)合研究中心組織編寫的 4790  多個(gè)實(shí) 驗(yàn)室轉(zhuǎn)基因分析方法 驗(yàn)證 的驗(yàn)證方法 》  （ of MO 。  本 標(biāo)準(zhǔn) 由國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會提出 并歸口 。  本 標(biāo)準(zhǔn) 起草單位： 中華人民共和國 北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 。  本 標(biāo)準(zhǔn) 主要起草人： 饒紅、 韓玥、 郭錚蕾、徐姍、李偉 。  本標(biāo)準(zhǔn)系首次發(fā)布的認(rèn)證認(rèn)可行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。  轉(zhuǎn)基因檢測 方法 驗(yàn)證 評價(jià) 指南  1 范圍  本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了轉(zhuǎn)基因 檢測 實(shí)驗(yàn)室 方法 驗(yàn)證 評 價(jià) 的術(shù)語和定義、利用協(xié)同實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 和 /或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)部數(shù)據(jù) 進(jìn)行 方法 驗(yàn)證 評價(jià) 的程序、方法、報(bào)告與表示。  本標(biāo)準(zhǔn)適用于 轉(zhuǎn)基因檢測 （如實(shí)時(shí)熒光 方法 驗(yàn)證 過程的評 價(jià) 、報(bào)告和表示。  2 規(guī)范性引用文件  下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。   基因產(chǎn)品檢測  通用要求和定義  3 術(shù)語和定義  下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。  方法 確認(rèn)   of 認(rèn)是 通過檢查并提供客觀證據(jù)，以證實(shí)某一特定預(yù)期用途的特定要求得到滿 足。 (7025 方法驗(yàn)證   of 證是通過 提供客觀證據(jù)，確認(rèn)特定要求得到滿足（ 000:2000 驗(yàn)證一個(gè)實(shí)驗(yàn)室能夠充分按照標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行操作需要實(shí)驗(yàn)室提供客觀證據(jù)，證明對于所用的樣品基質(zhì)，能滿足檢測方法規(guī)定的性能指標(biāo)。 通常，標(biāo)準(zhǔn)要求是 真實(shí)度 （ 一般用偏差形式表示 ） 和精確 度（一般為重復(fù)性和再現(xiàn)性），反映在測量不確定度中?？陀^證據(jù)是從 實(shí)驗(yàn)室實(shí)際數(shù)據(jù)中得到的真實(shí) 度和精確度。  可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差   可重復(fù)性（重現(xiàn)性）標(biāo)準(zhǔn)偏差是指在可重復(fù)性（重現(xiàn)性）條件下獲得的測試結(jié)果的散布的分布狀態(tài)的度量標(biāo)準(zhǔn)。相同地，“可重復(fù)性（重現(xiàn)性）變化”或“可重復(fù)性（重現(xiàn)性）變化系數(shù)”可以被定義或用于在可重復(fù)性（重現(xiàn)性）條件下獲得的測試結(jié)果的散布情況的度量標(biāo)準(zhǔn)。    實(shí)驗(yàn)室樣品  原始樣品經(jīng)過混合、縮分得到的一定數(shù)量樣品。用于制備試樣和存查樣品 。  分析樣品  驗(yàn)室通過研磨制備的樣品，必要時(shí)進(jìn)行混勻。  檢測部分  于檢測或分析的 樣品 ，其一次用于分析物提取的整體的量。  檢測結(jié)果  試結(jié)果是從     文中用到的） as in 從不同分析樣品的不同檢測部分得到的 本文中用到的 ) as in 用 對 工作溶液  續(xù)  定量 檢測低 限    定量分析過程的低限是指被檢測的樣品在合適的精確度水平上能被檢測出的最低含量或濃度，并且依據(jù) 727條款【 2】或【 3】，經(jīng)過合作實(shí)驗(yàn)的滿意證明或單一實(shí)驗(yàn)室的確認(rèn) 。  實(shí)際定量檢測低限    實(shí)際 定 /估計(jì)）目標(biāo)種類基因拷貝數(shù)的情況下，能定量到的可信的（如 ≥ 95%置信水平 ）最低相對目標(biāo)    檢測低限   定性方法的檢測限是指被檢測物能被可靠檢出的最低濃度或含量 。 但是不必進(jìn)行定量，并且已經(jīng)經(jīng)過合作實(shí)驗(yàn)的證明或單一實(shí)驗(yàn)室的確認(rèn)。  實(shí)際 檢測低限   實(shí)際 定 /估計(jì)） 目標(biāo)種類基因拷貝數(shù)的情況下，能檢測到的可信的（如 ≥ 95%置信水平 ）最低相對目標(biāo)  特異性  法只對特定特性或分析物有反應(yīng)的特點(diǎn)。  動態(tài)范圍 —定量檢測范圍    of 合作實(shí)驗(yàn)室證明了分析過程內(nèi)的濃度間隔具有適當(dāng)水平的精確度和 真實(shí) 度。  真實(shí)度  量實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值和 認(rèn)可參考值的一致性。  注：真實(shí)度（可信度）的量度標(biāo)準(zhǔn)通常是以斜率來表示的?？尚哦纫簿褪撬岬降摹捌骄档恼_度 ”。  精確度  規(guī)定條件下所獲得的獨(dú)立測試結(jié)果之間的一致性。  擴(kuò)增效率  個(gè)循環(huán)達(dá)到 100%效率時(shí)，使理論斜率達(dá)到 率（ %）可用以下公式計(jì)算：  效率 =(10(率 )× 100 R2 2是判定系數(shù)，是通過線性回歸分析得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（測量的 平方計(jì)算出的。    穩(wěn)健性   析方法的穩(wěn)健性是指在通常的使用情況下，檢測方 法不受微小、但有意的方法參數(shù)改變的影響，仍然能保持其測量可靠性的能力。  4 符號和 縮略語  下列符號和縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)。  CR to a  脫氧核糖核酸   MO 洲   盟    因改造    基因生物    際標(biāo)準(zhǔn)化組織     際電工委員會    of 測限     of 量檢測限    合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)  5 轉(zhuǎn)基因檢測方法 驗(yàn)證 評 價(jià)  取和純化   質(zhì)量的 管這個(gè) 標(biāo)準(zhǔn) 關(guān)注的是 是 為  個(gè)實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)的方法、標(biāo)準(zhǔn)方法（如  /或其它可利用的方法。  步驟： 對于已經(jīng)確認(rèn)的 次分 2份至少 2次（推薦 3次）進(jìn)行 果可能 的話，不在同一天內(nèi)進(jìn)行，并且由不同的操作者操作。提取的 ，通過 控制 擴(kuò)增效率和 用 實(shí)時(shí)熒光 否存在 抑制劑 ， 見附錄 B）。適用于一種基質(zhì)的 上步驟需要針對不同基質(zhì)進(jìn)行。對于一個(gè) 試的基質(zhì)不能含有轉(zhuǎn)基因成分。  度  步驟：提取的  驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)：在驗(yàn)證過程中，當(dāng)用于 取的 取的方法應(yīng)該能產(chǎn)生出滿足檢測目的的 少達(dá)到所需的    如果 方法不能 從特定基質(zhì)上提取 滿足檢測目的的 實(shí)際的 錄A） 。  取物中不含抑制劑  步驟：每個(gè)  40L）。從這個(gè)工作溶液， 進(jìn)行 一系列稀釋，如 4個(gè)稀釋點(diǎn)被用來進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光 個(gè)稀釋至少 2個(gè) 從 4個(gè)稀釋點(diǎn)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。  檢測抑制劑的 ，特定分類基因參考系統(tǒng)）。工作溶液中總的日常檢測中 用的 ， 。  驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)：測量 Δ該 < 測量 t)< 抑制劑曲線斜率在  抑制劑實(shí)驗(yàn)的例子見附錄 B. 如果提取的 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光 對  異性  特異性應(yīng)該在方法確認(rèn)時(shí)就已經(jīng)研究過了。因此，在方法驗(yàn)證時(shí)不需要對特異性再進(jìn)行研究。在對幾種轉(zhuǎn)基因成分共有的基因要素做方法篩選時(shí)，方法在進(jìn)行應(yīng)用后，應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)（如果不具備方法確認(rèn)的數(shù)據(jù)）先進(jìn)行和市場上新的轉(zhuǎn)基 因物質(zhì)交叉反應(yīng)的檢測。這也只有在具備新轉(zhuǎn)基因成分的陽性對照樣品時(shí)才能進(jìn)行。  力范圍、 數(shù)、擴(kuò)增效率  步驟：動力范圍、  真實(shí) 度和精確度時(shí)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線可以自動得出。 應(yīng)采用至少兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線的平均值 （見表 1）。  動力范圍驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)：動力范圍必須覆蓋預(yù)期使用的值?？梢杂棉D(zhuǎn)基因成分 %或 拷貝 數(shù)范圍表示。  例：   標(biāo)轉(zhuǎn)基因濃度或當(dāng)目標(biāo)為 500拷貝時(shí)的 50和 2500基因組拷貝  擴(kuò)增效率的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)：對定性和定量方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的平均值在 相當(dāng)于擴(kuò)增效率在 90   實(shí) 度  步驟：真實(shí) 度應(yīng)該接近規(guī)定值（如 值），或根據(jù)方法的預(yù)期使用需要，而且至少在接近 實(shí) 度的測量可以用標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)（ 至少 2個(gè)濃度（如  1%），可能的話，用在動力范圍之上的 第 3個(gè) 濃度（如 5%）?；蛘?，用一個(gè)更高比例的標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)制成參考樣品（如 1%）。附錄  檢測條件（反應(yīng)量、 該和日常檢測一致。至少要得到 16個(gè) 測的設(shè)計(jì)實(shí)例見表 1、 圖 2和圖 3. 附錄 關(guān)或不相關(guān)的轉(zhuǎn)基因成分平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算方法。    如果沒有標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)進(jìn)行真實(shí) 度的評估，可以用能力驗(yàn)證材料或能力 驗(yàn)證 的 。  驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)：真實(shí) 度在可接受參考值的± 25%內(nèi)，或 2之間。  對可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差（  步驟：重復(fù)性的評估和真實(shí) 度的 評估 方法相似。是在重復(fù)條件下通過 復(fù)性適用于所有轉(zhuǎn)基因水平的測試。  檢測條件（反應(yīng)量、 該和日常檢測一致。至少要得到 16個(gè)獨(dú)立測量結(jié)果。檢 測的設(shè)計(jì)實(shí)例見表 1、圖 2和圖 3. 附錄 關(guān)或不相關(guān)的轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算方法。  驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)：相對重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng) ≤25%，在方法的動力學(xué)范圍之上。  量限（ 評估  可 以確定相對 %）和 /或絕對 拷貝 數(shù)）。  相對 驟： 陽性對照樣品可以用目標(biāo)轉(zhuǎn)基因的 10次 0次平行進(jìn)行分析。 5%。為了建立準(zhǔn)確的 要用低濃度的轉(zhuǎn)基因物質(zhì)配制溶液。  絕對 驟： 1%的 已 知陽性對照樣品的一系列稀釋可以用 10次  80， 60，40， 20， 10， 5和 1）。 量的 5%。標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)該覆蓋  概率分布建議 1個(gè)拷貝應(yīng)該給出大約 30%的陰性結(jié)果。因此，為了驗(yàn)證稀釋系列的拷貝數(shù)大致正確，1個(gè)拷貝的稀釋液至少一個(gè)平行結(jié)果得是陰性的。  10次 要標(biāo)準(zhǔn)曲線滿足 效率的要求。其它的標(biāo)準(zhǔn)曲線只需要在每個(gè)點(diǎn)做 2個(gè)  驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng) 有確認(rèn)數(shù)據(jù)時(shí)， 或 好于）那些數(shù)據(jù)。  測限（ 評估  可以確定相對 %）和 /或絕對 拷貝 數(shù)）。  相對 驟：一個(gè)低轉(zhuǎn)基因濃度的陽性對照樣品可以用 10次 果所有平行的結(jié)果都是陽性，這表示  絕對 驟：計(jì)算一個(gè)方法 95%置信水平的 要 每個(gè) 濃度進(jìn)行 60個(gè) 于此方法并不實(shí)用，建議計(jì)算少量平行，如 10次平行的假陰性率。假陰性率要低于 5%（如， 10個(gè) 這個(gè)方法可以進(jìn)行  假陰性率是指一個(gè)已知陽性樣品被檢測成陰性的可能性。當(dāng)分析物的量接近方法的 會出現(xiàn)假陰性率的增加。選取稀釋的系列，使其能代表基于對方法性能的認(rèn)知的高于和低于預(yù)期  20、 10、 5和 1拷貝）。 10個(gè)平行都是陽性的最低濃度是 率分布建議 1個(gè)拷貝應(yīng)該有大約 30%的陰性結(jié)果。因此，為了驗(yàn)證稀釋 系列正確的拷貝數(shù)，至少 1個(gè)拷貝稀釋的一個(gè)平行需要是陰性的。見表 1. 驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)有確認(rèn)數(shù)據(jù)時(shí)，    實(shí)際 出了本文的范圍，因?yàn)?要取決于樣品而不是 方法。但是應(yīng)該對每個(gè)樣品確定  健性  在對方法進(jìn)行協(xié)作實(shí)驗(yàn)前，在方法開發(fā)或優(yōu)化時(shí)就應(yīng)該對穩(wěn)健性進(jìn)行研究， 因此，在驗(yàn)證研究中不用對穩(wěn)健性再進(jìn)行評估。  關(guān)樣品  當(dāng)有新的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品出現(xiàn)在市場上時(shí)，實(shí)驗(yàn)室希望得到檢測方法的通知。但是，在方法驗(yàn)證階段通常只有有證 參考 物質(zhì)。因此，通常使用有證 參考 物質(zhì) 進(jìn)行驗(yàn)證 。如果沒有 有證 參考 物質(zhì)，可以用其它的轉(zhuǎn)基因陽性 樣品 。也可以對日常樣品 或添加參考物質(zhì)的日常樣品進(jìn)行額外 檢測。  表 法的驗(yàn)證設(shè)置實(shí)例   預(yù)實(shí)驗(yàn)確定 合適濃度  在 范圍里至少測試 3 個(gè)目標(biāo)濃度（取決于植物物種）  如， 300米 應(yīng)大約 110000 內(nèi)源性 基因拷貝， 應(yīng)大約 37 拷貝。  數(shù)和擴(kuò)增效率  例 1： 2 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低要求  每個(gè)曲線用 5 個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)，做 3 個(gè) 行（× 3）  所有斜率都應(yīng)該在  間，所有 應(yīng)該≥  2： 4 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線  每個(gè)曲線用 5 個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)，做 2 個(gè) 行（× 2）  用 4 個(gè)斜率和 平均值進(jìn)行 驗(yàn)證 。  例 3： 2 個(gè)校準(zhǔn)曲線  每個(gè)曲線用 8 個(gè)點(diǎn)，做 5 個(gè) 行 （ × 5） ，覆蓋  最低濃度。用所有 上部分的斜率和 平均值 進(jìn)行 驗(yàn)證 。  ，精確度， 少兩個(gè)轉(zhuǎn)基因水平（一個(gè)近似于標(biāo)簽閾值，一個(gè)近似于 薦將動力范圍的上限作為第三個(gè)水平）  例 1：每個(gè)轉(zhuǎn)基因水平做兩個(gè) 取的平行，每個(gè)提取 /板做 2 個(gè) 行，4 個(gè)板得到 16 個(gè)測量結(jié)果，每個(gè)轉(zhuǎn)基因水平得 到 8 個(gè)評估 *（圖 2）  例 2：每個(gè)轉(zhuǎn)基因水平做兩個(gè) 取的平行，每個(gè)提取 /板做 4 個(gè) 行，2 個(gè)板得到 16 個(gè)測量結(jié)果，每個(gè)轉(zhuǎn)基因水平的到 4 個(gè)評估 *（圖 3）  為了評估中間精密度，由同一個(gè)實(shí)驗(yàn)員在兩天里分別進(jìn)行 驗(yàn)，如果可能，由兩名實(shí)驗(yàn)員實(shí)驗(yàn)。  一個(gè)低濃度的 10 個(gè) 行（如 80、 60、 40、 20、 10、 5 和 1 個(gè)拷貝）。當(dāng)拷貝數(shù)測量 的 于 25%并且標(biāo)準(zhǔn)曲線覆蓋了這個(gè)點(diǎn)的一系列濃度中的最低濃度。  一個(gè)低濃度的 10個(gè)  20、 10、 5和 1個(gè)拷貝）。  *如果基于經(jīng)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室能夠證 明兩個(gè)經(jīng)驗(yàn)豐富的操作者的平行和一個(gè)操作者的平行是一樣的，就無需兩個(gè)操作者 完成重復(fù) 了。  注意： 也可 同時(shí)評估表 1 中的參數(shù)。  注意：針對一次實(shí)驗(yàn) ， 標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品要在同一個(gè)板上。兩次實(shí)驗(yàn)（如內(nèi) 源 基因 和轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)）可以在兩個(gè)不同板上進(jìn)行，每個(gè)板使用相同的樣品稀釋液和同一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。    圖 2：精確度 /真實(shí) 度實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（例 1）  圖 3：精確度 /真實(shí) 度實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（例 :2）  附  錄  A （資料性附錄）  量對實(shí)際 影響    如表 2所示，在 基因樣品中， 目標(biāo)分類單元特定序列 的拷貝數(shù)是目標(biāo)轉(zhuǎn)基因成分的 1000倍以上。這表示，對于 10個(gè)拷貝的絕對 要將 10000個(gè) 目標(biāo)分類單元特定序列 的拷貝進(jìn)行 實(shí)際 果絕對 0個(gè)拷貝，用 1000000個(gè)拷貝進(jìn)行 么實(shí)際 見表 2）。應(yīng)該對每個(gè)樣品進(jìn)行實(shí)際  表 量對實(shí)際 響的例子  因拷貝數(shù)  絕對 標(biāo)轉(zhuǎn)基因  復(fù)制數(shù) ) 實(shí)際 %）  100,000  10 0,000 10 000 10 1   A  B  附  錄  B （資料性附錄）  對 取方法的評價(jià)（抑制試驗(yàn)）  景  已知的抑制 擾 而影響目標(biāo) 是，一個(gè)樣品中抑制劑的最終的量取決于樣品的性質(zhì)。樣品被加工的程度越深， 物 生 代謝物如多酚、脂類和能夠與 可以通過子洗滌劑、乙醇、異丙醇和苯酚。  為了在 以采取不同的措施。這個(gè)附錄說明了 率和 以及檢測用于  抑制的作用基本上取決于抑制物的濃度。當(dāng) 制物的效果通常會在 連續(xù)稀釋樣品的反應(yīng)效率的評價(jià)和對不含抑制劑的未稀釋樣品的理論 界循環(huán)次數(shù)）和測量 可以 得到 果只有最高 濃度 是這會影響實(shí)際的  但是，在特定情況下連接在 樣就會導(dǎo)致可以擴(kuò)增的  驟  以通過用 目標(biāo)分類單元特定序列 系統(tǒng)，每個(gè) 制運(yùn)行）的連續(xù) 4倍稀釋（ 1:4、 1:16、 1:64和 1:256）的 4個(gè)點(diǎn)分析 2個(gè) 達(dá)到 接下來的  關(guān)的水平的 做“未稀釋”樣品（工作稀釋）。從這個(gè)濃度開始準(zhǔn)備四倍稀釋液（從 1:4到 1:256）。為了評估抑制劑的存在， 4個(gè)按系列稀釋的樣品的 用線性回歸計(jì)算得到一個(gè)等式。從線性回歸推算出的“未稀釋”樣品的 被接受的 三個(gè)條件：回歸線的斜率在 定系數(shù)（ 于或高于 測量  于  每個(gè)稀釋得出的兩個(gè)   下圖藍(lán)色格的“工作稀釋”反映了“未稀釋樣品”。  例 A：可接受 足所有標(biāo)準(zhǔn)    例 B： 制。 盡管 ?超過 限制 (盡管 接近這個(gè)值 )， 未稀釋的樣本和 1:4 稀釋樣品 發(fā)生了 延遲反應(yīng)  (說明 量不佳 。 后者對斜率的 影響 表現(xiàn)為 斜 率 比可接受的 (坦 。  例如 C:制。這是另一 種 取 物質(zhì)量低 的情況 。 連續(xù)稀釋 的斜率在可接受范圍內(nèi) ,然而 ,基于四點(diǎn)直線的 未稀釋樣本的 推斷 應(yīng)低于測量 (23)。 未稀釋樣本顯示出上升的延遲，以至于不如后來的 1:4 稀釋樣本 明顯 。 因此 ,當(dāng)線性回歸的斜率 落在 范圍 明 混 合物 的提取物 抑制 增。  例 D:在這個(gè)例子中 ,回歸直線的斜率 在 受 標(biāo)準(zhǔn) 之外 (- 然而 , 與 例子 B 相反 , 未稀釋樣本和第一 個(gè)梯度稀釋 樣本沒有出現(xiàn) 遲 。 ―?列顯示后續(xù) 梯度稀釋 樣品的 測量 間的 區(qū)別。這些值總是大于 反應(yīng)效率 100%時(shí)的 期望值 2。基本上 ,稀釋列 表現(xiàn)的 好像 稀釋 樣品 中的  計(jì)算 的少。 因此 ,我們不希望把這 些 樣本歸為受 抑制 化合物 影響的樣本 。然而 ,如果排除技術(shù)錯誤  (移液錯誤 ),也 沒有其他 能明確識別 的 原因 , 不應(yīng)該排除對附含目標(biāo) 制劑可能性的推測 。      B  C  附  錄  C （資料性附錄）  中間濃度 陽性 對照 的生產(chǎn)  一些參考 物質(zhì) 只在一個(gè)或幾個(gè)有限的 轉(zhuǎn)基因 濃度 可用 ?？赡苄枰獙?陽性 材料與非轉(zhuǎn)基因材料 混合生產(chǎn)其他 轉(zhuǎn)基因 濃度 ， 如確定相對 以通過測量 同一板子上同一標(biāo)準(zhǔn)曲線的陽性轉(zhuǎn)基因和陰性轉(zhuǎn)基因 的參考基因 來完成。 這兩個(gè)  稀釋因子可以使用以下公式計(jì)算 : X = (A/B)*(1 X =實(shí)際稀釋系數(shù) (轉(zhuǎn)基因材料必須 被稀釋 多少 以抵消 濃度 的差異 ) A =陽性轉(zhuǎn)基因  參考基因拷貝 數(shù)  B =陰性 轉(zhuǎn)基因  參考基因拷貝數(shù)  Y =理論稀釋因子 ，如 從 10%轉(zhuǎn)基因到 基因 =100x 例子：   = 100%  = 0% 的每個(gè) μL  參考基因校準(zhǔn)曲線 上 量化未知樣品  結(jié)果：  A (來自 ): 10 拷貝 /5μL B (來自  ): 8 拷貝 /5μL 從 100%轉(zhuǎn)基因生產(chǎn) 10%轉(zhuǎn)基因 相當(dāng)于 10倍稀釋 (理論上 Y=10)。  X 必須像 Y 一 樣 用 于 計(jì) 算 混 合 的 體 積 。  如果 X=那么 實(shí)際稀釋 因子 X ：(10/8)*(101=((10/8)*9) +1= 90/8 + 1 = = 所以  1μL A 需要與 混合。  在將這兩個(gè) 到一起后， 全 混合。  混合物的純度可以通過 100%的混合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線 ， 分別在 3天 以 3個(gè)平行 分析 3個(gè)樣品 。    C  D  附  錄  D （資料性附錄）  基于實(shí)時(shí) 轉(zhuǎn)基因含量平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差的評估  大部分實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)已經(jīng)寫明如何從 用兩種方法計(jì)算出的平均值再通過兩個(gè)步驟相加 。 下 面詳述 從目標(biāo)基因和參考基因拷貝數(shù)測量值 開始 的過程。通過 這些測試結(jié)果 , 計(jì)算 轉(zhuǎn) 基因 含量的 估計(jì) 值 和標(biāo)準(zhǔn)偏差。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)過程提供幾個(gè)這樣的 轉(zhuǎn)基因含量和標(biāo)準(zhǔn)偏差 值 (例如 , 在相同或不同的板 子上 運(yùn)行 )。需要和適當(dāng) 時(shí) ,這些 評估 可以 通過 標(biāo)準(zhǔn)方式 相加 ,例如通過轉(zhuǎn)基因含量計(jì)算 算術(shù)平均 值 。   目標(biāo)和參考基因拷貝數(shù)估計(jì) 轉(zhuǎn)基因含量   估計(jì) 轉(zhuǎn)基因 分比需要 用到 兩個(gè) 實(shí)驗(yàn) :一個(gè)試驗(yàn)是用來檢測目標(biāo) 轉(zhuǎn)基因 X)， 另一種是用于確定內(nèi) 源 參考基因 Y)。 轉(zhuǎn)基因 分比的估計(jì) 通常 使用以下的 比率法：  .          (1) 都是隨機(jī) 變 量 1。 1 一個(gè)隨機(jī)變量可以被認(rèn)為是一個(gè) 值 不固定值 的量 ，但可以根據(jù)概率分布取不同的值 (例如，可能是由測量不確定度決定的 )。 通常 使用大寫字母 表示一個(gè) 隨機(jī)變量 (即 ，  ，使用 小字母 表示實(shí)際值 ， 即測量結(jié)果。  標(biāo)準(zhǔn)的做法是 將 目標(biāo)和參考基因 一式兩份或 一式三份等 來進(jìn)行試驗(yàn) 。 這樣將分別得到 2到 3個(gè)轉(zhuǎn)基因目標(biāo) 到 3個(gè) 參考基因 著需要根據(jù)這兩組檢測結(jié)果計(jì)算轉(zhuǎn)基因百分比 的平均值。 然而 沒有計(jì)算 隨機(jī)變量 比率 的均值和方差 的 準(zhǔn)確公式 ， 但存在近似 值。平均值， 用 獨(dú)立隨機(jī)變量 比率 的方差 接近于  (2) 和  (3) 其中 是目標(biāo)轉(zhuǎn)基因  是參考  這些近似 值 假設(shè) 之間 不 相關(guān) 。 標(biāo)準(zhǔn)偏差 用 表示。標(biāo)準(zhǔn)偏差組分中的相對可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差 后用標(biāo)準(zhǔn)偏差的分量計(jì)算 ； 以下示例給出了 算方法 。  所有這些計(jì)算可以 用   子    在這些例子中 ,我們使用  些例子對應(yīng)表 1中給出的示例 并 詳細(xì)演示 了 一個(gè) 板子所 需 的 計(jì)算 ， 然后描述 如何 計(jì)算幾個(gè) 板子 結(jié)果的總和。  示例 1:兩個(gè) 每個(gè)提取 的轉(zhuǎn)基因 目標(biāo)和參考基因都在四個(gè) 板子上通過 兩個(gè) 行測試  這個(gè)設(shè)計(jì) 針對每個(gè)板子 提供了兩種 轉(zhuǎn)基因估計(jì)值 和標(biāo)準(zhǔn)偏差  ， 因此 總共有 8個(gè)轉(zhuǎn)基因估計(jì)值( 8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差 (這 8個(gè)轉(zhuǎn)基因估計(jì)值 和標(biāo)準(zhǔn)差 都得自 使用方程 (1)和 (2)計(jì)算 兩個(gè) 測試結(jié)果 中目標(biāo)基因拷貝數(shù)和參考基因拷貝數(shù)。如果 得到 所有 8個(gè) 轉(zhuǎn)基因估計(jì)值 的平均值 ， 這個(gè)平均價(jià)值取決于 16個(gè) 目標(biāo)基因的拷貝數(shù)和 16個(gè)參考基因的拷貝數(shù) 的 測試結(jié)果 ， 這當(dāng)然也適用于組合標(biāo)準(zhǔn)差。  提取 1: 因此， 163977， x) = y) = 104227922。 將適當(dāng)?shù)闹捣湃敕匠?2)得出一個(gè)平均值  使用方程 (3)和上述 值 開方 得到 標(biāo)準(zhǔn)差  提取 2：  這 里，   166498， x) = y) = 62518562。 將適當(dāng)?shù)闹捣湃敕匠?(2)得出一個(gè)平均值  使用方程 (3)和上述 值 開方得到 標(biāo)準(zhǔn)差  結(jié)合板 子：  在四個(gè)不同的板 子重復(fù) 整個(gè)過程 ，除了  還得到 平均值  , 標(biāo)準(zhǔn)差  ,  樣本 轉(zhuǎn)基因 的總體 平均值 可以通過  術(shù)平均 值 計(jì)算 。 使用 個(gè)提取的 平行 數(shù) (在這個(gè)例子中 n = 2)，用 量  (這里 k = 8)， 整體平均 的標(biāo)準(zhǔn)差  ；在這個(gè)示例中分母的區(qū)間是 16 –  8 = 8。相對可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差 。  示例 2： 兩個(gè) 為每個(gè)提取 的轉(zhuǎn)基因 目標(biāo)和參考基因都在 兩 個(gè) 板子上通過 四 個(gè) 行測試  這個(gè)設(shè)計(jì) 針對每個(gè)板子 提供了兩種 轉(zhuǎn)基因估計(jì)值 和標(biāo)準(zhǔn)偏差  ， 因此 總共有 4個(gè)轉(zhuǎn)基因估計(jì)值( 4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差 (這 4個(gè)轉(zhuǎn)基因估計(jì)值 和標(biāo)準(zhǔn)差 都得自 使用方程 (1)和 (2)計(jì)算四 個(gè)測試結(jié)果 中目標(biāo)基因拷貝數(shù)和參考基因拷貝數(shù)。如果 得到 所有 4個(gè) 轉(zhuǎn)基因估計(jì)值 的平均值 ， 平均 值取決于 如上述示例 1中的 16個(gè) 目標(biāo)基因的拷貝數(shù)和 16個(gè)參考基因的拷貝數(shù) 的 測試結(jié)果 ， 這當(dāng)然也適用于組合標(biāo)準(zhǔn)差。    提取 1: 因此，  x) =1433394， y) = 57700642。應(yīng)用方程 (2)得出一個(gè)平均值 使用方程 (3)和上述值 開方 得到標(biāo)準(zhǔn)差  提取 2：  這里，  14187，  157308， x) = 747515， y) = 89272181。應(yīng)用方程 (2)得出一個(gè)平均值 使用方程 (3)和上述值 開方 得到標(biāo)準(zhǔn)差  結(jié)合板 子：  在兩個(gè)不同的板子重復(fù)整個(gè)過程，除了  還得到 平均值  樣本轉(zhuǎn)基因的總體平均值 可以通過  術(shù)平均值 計(jì)算 。使用 行 數(shù) (在這個(gè)例子中 n = 4)，用 (這里 k = 4)， 整體平均的標(biāo)準(zhǔn)差  ；在這個(gè)示例中分母的區(qū)間是 16 – 4 = 12。相對可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差  。