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1、植 物 組 織 培養(yǎng) 技 術(shù)Plant Tissue Culture 2021-5-6 2 二 、 相 關(guān) 知 識 離 體 （ in vitro)條 件 下 利 用 人 工 培 養(yǎng) 條 件在 無 菌 情 況 下 培 養(yǎng) 、 生 長 、 發(fā) 育 再 生 出 完 整植 株 的 過 程 。 1958年 ， 英 國 科 學(xué) 家 Steward 等 用 胡 蘿卜 根 的 愈 傷 組 織 細 胞 進 行 懸 浮 培 養(yǎng) ， 成 功 誘導(dǎo) 出 胚 狀 體 并 分 化 為 完 整 的 小 植 株 ， 不 但 使細 胞 全 能 性 理 論 得 到 證 實 ， 而 且 為 組 織 培 養(yǎng)的 技 術(shù) 程 序 奠 定

2、 了 基 礎(chǔ) 。 2021-5-6 3 應(yīng) 用 領(lǐng) 域 1、 快 速 繁 殖 運 用 組 織 培 養(yǎng) 的 途 徑 ， 一 個 單 株一 年 可 以 繁 殖 幾 萬 到 幾 百 萬 個 植 株 。 例 如 一 株 蘭 花一 年 繁 殖 到 400萬 株 。 2、 種 苗 脫 毒 針 對 病 毒 對 農(nóng) 作 物 造 成 的 嚴 重 危害 ， 通 過 組 織 培 養(yǎng) 可 以 有 效 地 培 育 出 大 量 的 無 病 毒種 苗 。 3、 遠 緣 雜 交 利 用 組 織 培 養(yǎng) 可 以 使 難 度 很 大 的遠 緣 雜 交 取 得 成 功 ， 從 而 育 成 一 些 罕 見 的 新 物 種 。二 、

3、相 關(guān) 知 識 2021-5-6 4 應(yīng) 用 領(lǐng) 域 4、 突 變 育 種 采 用 組 織 培 養(yǎng) 可 以 直 接 誘 變 和 篩選 出 具 抗 病 、 抗 鹽 、 高 賴 氨 酸 、 高 蛋 白 等 優(yōu) 良 性 狀的 品 種 。 5、 基 因 工 程 基 因 工 程 主 要 研 究 DNA的 轉(zhuǎn) 導(dǎo) ，而 基 因 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 后 必 須 通 過 組 織 培 養(yǎng) 途 徑 才 能 實 現(xiàn) 植 株再 生 。 6、 生 物 制 品 有 些 極 其 昂 貴 的 生 物 制 品 ， 如 抗癌 首 選 藥 物 -紫 杉 醇 等 ， 可 通 過 組 織 培 養(yǎng) 方 式 生 產(chǎn) 。二 、 相 關(guān) 知 識 2021

4、-5-6 5 植 物 組 織 培 養(yǎng) 的 分 類 廣 義 的 組 織 培 養(yǎng) 依 外 植 體 不 同 ， 可 分 為 ： 1) 器 官 培 養(yǎng) （ organ culture） 2)莖 尖 分 生 組 織 培 養(yǎng) (shoot tip culture, apical meristem culture) 3)愈 傷 組 織 培 養(yǎng) (calluse cultrue) 4)細 胞 培 養(yǎng) (cell culture) 5)原 生 質(zhì) 體 培 養(yǎng) (protoplast culture)二 、 相 關(guān) 知 識 元 貝 駕 考 http:/ 元 貝 駕 考 2016科 目 一 科 目 四金 手 指 考

5、 試 http:/ 金 手 指 駕 駛 員 考 試 2021-5-6 7 外 植 體 (explant)： 由 活 體 （ in vivo)植 物體 上 提 取 下 來 的 ， 接 種 在 培 養(yǎng) 基 上 的 無菌 細 胞 、 組 織 、 器 官 等 。 愈 傷 組 織 (callus)： 在 人 工 培 養(yǎng) 基 上 由 外植 體 上 形 成 的 一 團 無 序 生 長 狀 態(tài) 的 薄 壁細 胞 。 二 、 相 關(guān) 知 識 2021-5-6 8 二 、 相 關(guān) 知 識 2021-5-6 9 二 、 相 關(guān) 知 識 2021-5-6 10 二 、 相 關(guān) 知 識 2021-5-6 11 二 、

6、相 關(guān) 知 識 2021-5-6 12 二 、 相 關(guān) 知 識 二 、 相 關(guān) 知 識 2021-5-6 14 植 物 組 織 培 養(yǎng) 特 點 培 養(yǎng) 條 件 可 以 人 為 控 制 生 長 周 期 短 ， 繁 殖 率 高 管 理 方 便 ， 利 于 工 廠 化 生 產(chǎn) 和 自 動 化控 制 二 、 相 關(guān) 知 識 2021-5-6 15 植 物 組 織 培 養(yǎng) 營 養(yǎng) 條 件 -培 養(yǎng) 基(Culture Medium) 培 養(yǎng) 基 是 植 物 組 織 培 養(yǎng) 的 重 要 基 質(zhì) 。 培 養(yǎng) 基 的 成 分 主 要 可 以 分 水 、 無 機 鹽 、有 機 物 、 天 然 復(fù) 合 物 、 培

7、 養(yǎng) 體 的 支 持 材料 等 五 大 類 。二 、 相 關(guān) 知 識 2021-5-6 16 國 際 上 流 行 的 培 養(yǎng) 基 有 幾 十 種 ， 常用 的 培 養(yǎng) 基 有 ： MS培 養(yǎng) 基 、 B5培 養(yǎng) 基 、 White培 養(yǎng) 基 、 N6培 養(yǎng) 基 、 KM-8P培 養(yǎng) 基二 、 相 關(guān) 知 識 2021-5-6 17 常 用 培 養(yǎng) 基 簡 介 -MS培 養(yǎng) 基 1962年 由 Murashige和 Skoog為 培 養(yǎng) 煙 草 細 胞 而設(shè) 計 的 。 特 點 是 無 機 鹽 和 離 子 濃 度 較 高 ， 為 較 穩(wěn) 定的 平 衡 溶 液 。 其 養(yǎng) 分 的 數(shù) 量 和 比

8、例 較 合 適 ， 可 滿 足植 物 的 營 養(yǎng) 和 生 理 需 要 。 它 的 硝 酸 鹽 含 量 較 其 他 培養(yǎng) 基 為 高 ， 廣 泛 地 用 于 植 物 的 器 官 、 花 藥 、 細 胞 和原 生 質(zhì) 體 培 養(yǎng) ， 效 果 良 好 。 有 些 培 養(yǎng) 基 是 由 它 演 變而 來 的 。 二 、 相 關(guān) 知 識 2021-5-6 18 常 用 培 養(yǎng) 基 簡 介 -B5培 養(yǎng) 基 是 1968年 由 Galmborg等 為 培 養(yǎng) 大 豆 根 細 胞 而 設(shè)計 的 。 其 主 要 特 點 是 含 有 較 低 的 銨 ， 這 可 能 對 不 少培 養(yǎng) 物 的 生 長 有 抑 制 作

9、 用 。 從 實 踐 得 知 有 些 植 物 在B5培 養(yǎng) 基 上 生 長 更 適 宜 ， 如 雙 子 葉 植 物 特 別 是 木 本植 物 。 二 、 相 關(guān) 知 識 2021-5-6 19 常 用 培 養(yǎng) 基 簡 介 -White培 養(yǎng) 基 是 1943年 由 White為 培 養(yǎng) 番 茄 根 尖 而 設(shè) 計 的 。1963年 又 作 了 改 良 ， 稱 作 White改 良 培 養(yǎng) 基 ， 提 高 了MgSO4的 濃 度 和 增 加 了 硼 素 。 其 特 點 是 無 機 機 鹽 數(shù) 量較 低 ， 適 于 生 根 培 養(yǎng) 。二 、 相 關(guān) 知 識 2021-5-6 20 常 用 培 養(yǎng)

10、基 簡 介 N6培 養(yǎng) 基 是 1974年 朱 至 清 等 為 水 稻 等 禾 谷 類 作 物 花 藥 培養(yǎng) 而 設(shè) 計 的 。 其 特 點 是 成 分 較 簡 單 ， KNO3和 （ NH4）2SO4含 量 高 。 在 國 內(nèi) 已 廣 泛 應(yīng) 用 于 小 麥 、 水 稻 及 其他 植 物 的 花 藥 培 養(yǎng) 和 其 他 組 織 培 養(yǎng) 。二 、 相 關(guān) 知 識 2021-5-6 21 常 用 培 養(yǎng) 基 簡 介 KM-8P培 養(yǎng) 基 1962年 由 Murashige和 Skoog為 培 養(yǎng) 煙 草 細 胞 而設(shè) 計 的 。 特 點 是 無 機 鹽 和 離 子 濃 度 較 高 ， 為 較 穩(wěn)

11、 定的 平 衡 溶 液 。 其 養(yǎng) 分 的 數(shù) 量 和 比 例 較 合 適 ， 可 滿 足植 物 的 營 養(yǎng) 和 生 理 需 要 。 它 的 硝 酸 鹽 含 量 較 其 他 培養(yǎng) 基 為 高 ， 廣 泛 地 用 于 植 物 的 器 官 、 花 藥 、 細 胞 和原 生 質(zhì) 體 培 養(yǎng) ， 效 果 良 好 。 有 些 培 養(yǎng) 基 是 由 它 演 變而 來 的 。 二 、 相 關(guān) 知 識 2021-5-6 22 不 同 營 養(yǎng) 條 件 對 植 物 組 織 培 養(yǎng) 的 影 響 G rowth medium is optimised for regeneration of plantlets No s

12、ucrose (0%)Sucrose reduced to 1% Sucrose increased to 5%T h e e x p l a n t i s completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface Very few shoots have developed on the explant. No roots and no callus.Shoots developed on edges of upper surface, a n d s o m e r o o t

13、development has occured Shoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control medium 二 、 相 關(guān) 知 識 No BAP BAP reduced to 0.1 mg. l-1 No NAA Poor shoot development and no roots. Extensive callus generationPoor shoot dev

14、elopment and no roots NAA reduced to 0.1 mg. l-1More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explantProfuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant 二 、

15、相 關(guān) 知 識 NAA increased to 5.0 mg. l-1Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callus No MS saltsNo sign of regeneration from explant at all. MS salts reduced to 0.47 g. l -1 Some root growth but reduced development of shoots MS salts increased to 9.5

16、2 g. l-1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus. 二 、 相 關(guān) 知 識 2021-5-6 25 植 物 細 胞 的 全 能 性 植 物 細 胞 具 有 該 植 物 體 全 部 遺 傳 的 可 能 性 ， 在 一定 條 件 下 具 有 發(fā) 育 成 完 整 植 物 體 的 潛 在 能 力 。 差 異 :(1) 受 精 卵 的 全 能 性 最 高 (2) 受 精 卵 分 化 后 的 細 胞 中 ， 體 細 胞 的 全 能 性 比生 殖 細 胞 的 低 。 潛 在 全 能 性 的 原 因 ： 基 因

17、表 達 的 選 擇 性 科 學(xué) 研 究 表 明 ， 處 于 離 體 狀 態(tài) 的 植 物 活 細 胞 ， 在一 定 的 營 養(yǎng) 物 質(zhì) 、 激 素 和 其 他 外 界 條 件 的 作 用 下 ， 就可 能 表 現(xiàn) 出 全 能 性 ， 發(fā) 育 成 完 整 的 植 株 。 人 工 條 件 下實 現(xiàn) 的 這 一 過 程 ， 就 是 植 物 組 織 培 養(yǎng) 。三 、 實 驗 原 理 2021-5-6 26 植 物 細 胞 全 能 性 的 表 達 脫 分 化 （ dedifferentiation)： 將 來 自 已 分 化 組織 的 已 停 止 分 裂 的 細 胞 從 植 物 體 部 分 的 抑 制 性

18、影 響 下 解 脫 出 來 ， 恢 復(fù) 細 胞 的 分 裂 活 性 。 再 分 化 （ redifferentiation):經(jīng) 脫 分 化 的 組 織 或細 胞 在 一 定 的 培 養(yǎng) 條 件 下 可 有 轉(zhuǎn) 變 為 各 種 不 同細 胞 類 型 的 能 力 。三 、 實 驗 原 理 2021-5-6 27 四 、 試 劑 和 器 材1、 材 料 新 鮮 胡 蘿 卜 莖2、 試 劑 MS培 養(yǎng) 基 10%亞 硫 酸 溶 液 2021-5-6 28 MS培 養(yǎng) 基 配 制 方 法四 、 試 劑 和 器 材 2021-5-6 29 四 、 試 劑 和 器 材3、 儀 器高 壓 滅 菌 鍋 、 超

19、 凈 工 作 臺 、 烘 箱 、 培 養(yǎng) 箱4、 玻 璃 器 皿試 劑 瓶 (50、 100、 1000ml)、 三 角 瓶 (100ml)、刻 度 吸 管 (0.5、 1、 5、 10ml)、 培 養(yǎng) 皿5、 用 具鑷 子 、 解 剖 刀 、 接 種 針 、 記 號 筆 、 封 口 膜 2021-5-6 30 離 體 的 植 物器 官 、 組 織 、細 胞 脫 分 化 愈傷組織 再 分 化 根芽 植物體五 、 操 作 步 驟 切 開 胡 蘿 卜 ， 在 圓 圈 處 取 一 塊 組 織P-木 質(zhì) 部 、 C-形 成 層 、 X-韌 皮 部五 、 操 作 步 驟 形 成 層 開 始 形 成 愈

20、傷 組 織C1-愈 傷 組 織 、 C2-形 成 層五 、 操 作 步 驟 3-4周 后 完 全 形 成 愈 傷 組 織 狀 態(tài) （ 脫 分 化 ）組 織 塊 失 去 色 素五 、 操 作 步 驟 把 脫 分 化 后 的 愈 傷 組 織 轉(zhuǎn) 移 到 培 養(yǎng) 基 上五 、 操 作 步 驟 兩 周 左 右 開 始 再 分 化 ， 長 出 幼 苗五 、 操 作 步 驟 將 幼 苗 移 植 到 外 部 條 件 下 培 養(yǎng) （ 順 化 ）五 、 操 作 步 驟 順 化 一 個 月 后 的 胡 蘿 卜 植 株五 、 操 作 步 驟 培 養(yǎng) 基 配 制 (I)母 液 配 制 ： 按 照 MS培 養(yǎng) 基 成

21、分 表 , 配 制 分 別 配 制 培 養(yǎng) 基 的母 液 。1、 大 量 元 素 母 液 (10倍 液 ) 分 別 稱 取 10倍 用 量 的 各 種 大 量 無 機 鹽 ， 依 次 溶解 于 大 約 800ml熱 的 （ 60-80 ） 蒸 餾 水 中 。 （ 一種 成 分 完 全 溶 解 后 再 加 入 下 一 種 ， 最 后 加 水 ， 定 容至 1000ml后 裝 入 試 劑 瓶 中 ， 冰 箱 內(nèi) 貯 存 備 用 ） 。五 、 操 作 步 驟 2、 微 量 元 素 母 液 (100倍 液 ) 分 別 稱 取 100倍 用 量 的 微 量 無 機 鹽 ， 依 次 溶 解于 800ml重

22、 蒸 水 中 ， 加 水 定 溶 到 1000ml。 3、 鐵 鹽 母 液 （ 100倍 液 ） 稱 取 100倍 用 量 的 Na2-EDTA(乙 二 胺 四 乙 酸 鈉 )和 FeSO47H2O， 溶 于 800ml重 蒸 水 中 ， 最 后 定 容到 1000ml。 五 、 操 作 步 驟培 養(yǎng) 基 配 制 (I )母 液 配 制 ： 4、 有 機 物 質(zhì) 母 液 (100倍 數(shù) ) 分 別 稱 取 50倍 用 量 的 各 種 有 機 物 質(zhì) ， 依 次 溶 解于 400ml重 蒸 水 中 ， 定 容 至 1000ml， 裝 入 棕 色 試 劑瓶 中 ， 貯 存 冰 箱 備 用 。 除

23、上 述 四 種 母 液 外 ， 培 養(yǎng) 基 中 經(jīng) 常 附 加 的 各 種生 物 素 和 細 胞 分 裂 素 也 要 配 成 母 液 貯 存 ， 臨 用 時 按濃 度 定 量 吸 取 加 入 。五 、 操 作 步 驟培 養(yǎng) 基 配 制 (I)母 液 配 制 ： 5、 生 長 素 如 2,4-D、 IAA、 NAA等 。 準 確 稱 取 20mg， 先用 2ml95%乙 醇 溶 解 ， 然 后 加 水 ， 定 容 至 20ml， 濃度 為 1mg/ml， 再 放 置 冰 箱 內(nèi) 貯 存 備 用 。 6、 細 胞 分 裂 素 如 激 動 素 (Kt)、 6-芐 基 嘌 呤 (6-BA)。 準 確

24、稱 取20mg， 先 用 2ml的 1mol/ml HCL或 NaOH溶 解 ， 然后 加 水 ， 定 容 至 20ml， 濃 度 為 1mg/ml， 再 放 置 冰箱 內(nèi) 貯 存 備 用 。五 、 操 作 步 驟培 養(yǎng) 基 配 制 (I)母 液 配 制 ： 取 1000ml燒 杯 一 只 ， 加 大 量 元 素 10倍 母 液100ml， 微 量 元 素 100倍 母 液 10ml， 鐵 鹽 100倍 母液 10ml,有 機 物 質(zhì) 100倍 母 液 10ml。 此 外 ,根 據(jù) 培 養(yǎng)材 料 和 實 驗 目 的 還 要 附 加 一 定 量 的 生 長 素 ,細 胞 分裂 素 及 蔗 糖 等

25、 ,然 后 加 水 至 1000ml,待 蔗 糖 充 分 溶 解后 用 1mol/L 的 NaOH或 HCl調(diào) 酸 堿 度 為 pH5.8,最 后加 入 瓊 脂 粉 6.5g,如 用 瓊 脂 條 ,則 要 加 8g。五 、 操 作 步 驟培 養(yǎng) 基 配 制 (II)配 制 與 分 裝 ： 將 盛 有 培 養(yǎng) 基 的 燒 杯 在 電 磁 爐 上 ， 煮 至 瓊 脂 完全 融 化 ， 補 加 蒸 餾 水 至 1000ml。 將 配 制 好 的 培 養(yǎng) 基 分 裝 到 培 養(yǎng) 用 三 角 瓶 中 ， 每只 100ml三 角 瓶 約 裝 40ml培 養(yǎng) 基 。 分 裝 時 要 避 免 把 培 養(yǎng) 基

26、倒 在 瓶 口 上 ， 否 則 培 養(yǎng)時 容 易 引 起 雜 菌 污 染 。 五 、 操 作 步 驟培 養(yǎng) 基 配 制 (II)配 制 與 分 裝 ： 1、 把 裝 好 的 培 養(yǎng) 基 的 三 角 瓶 放 入 高 壓 滅 菌 鍋 中 ，蓋 好 鍋 蓋 。2、 設(shè) 置 滅 菌 參 數(shù) 為 121 ， 20min， 開 始 滅 菌 。 五 、 操 作 步 驟培 養(yǎng) 基 配 制 (III)滅 菌 ： 1、 取 新 鮮 胡 蘿 卜 莖 ， 用 去 離 子 水 洗 凈 。2、 在 胡 蘿 卜 莖 上 切 一 塊 含 有 形 成 層 的 組 織 ， 放 入磨 口 三 角 瓶 中 ， 倒 入 適 量 10%

27、亞 硫 酸 溶 液 ， 輕 輕 搖動 15-30s。3、 倒 去 亞 硫 酸 溶 液 ， 無 菌 水 洗 滌 3-4次 ， 徹 底 清 除殘 留 葉 面 和 瓶 內(nèi) 的 亞 硫 酸 溶 液五 、 操 作 步 驟胡 蘿 卜 的 取 材 與 處 理 1、 先 用 肥 皂 洗 手 ， 穿 上 工 作 服 ， 戴 上 口 罩 和 工 作帽 。2、 放 入 培 養(yǎng) 瓶 和 滅 菌 后 的 接 種 用 具 (鑷 子 、 解 剖 刀、 接 種 針 )， 把 鑷 子 、 解 剖 刀 、 接 種 針 插 入 內(nèi) 盛70%酒 精 的 廣 口 瓶 中 。3、 用 鑷 子 把 胡 蘿 卜 夾 入 培 養(yǎng) 皿 內(nèi) 的

28、吸 水 紙 上 ， 吸干 水 珠 ， 把 胡 蘿 卜 切 成 含 有 “ 木 質(zhì) 部 ” 、 “ 形 成 層” 和 “ 韌 皮 部 ” 三 部 分 的 小 塊 。五 、 操 作 步 驟接 種 4、 小 心 打 開 三 角 瓶 ， 把 組 織 塊 投 入 瓶 內(nèi) ， 用 接 種針 撥 勻 ， 蓋 上 封 口 膜 。5、 用 記 號 筆 在 瓶 壁 上 寫 明 培 養(yǎng) 材 料 、 培 養(yǎng) 基 代 號、 接 種 日 期 。五 、 操 作 步 驟接 種注 意 事 項 全 部 接 種 操 作 都 是 在 無 菌 條 件 下 進 行 的 ， 所 以要 特 別 認 真 仔 細 ， 以 防 雜 菌 污 染 。 接 種 完 畢 后 ， 取 出 培 養(yǎng) 瓶 中 ， 置 于 2628 光照 培 養(yǎng) 箱 中 培 養(yǎng) 。 觀 察 記 錄 生 長 情 況 ， 并 照 相 存 檔 。五 、 操 作 步 驟培 養(yǎng) 1、 植 物 組 織 培 養(yǎng) 技 術(shù) 有 哪 些 實 際 用 途 ？ 2、 植 物 激 素 與 器 官 分 化 有 何 關(guān) 系 ？3、 怎 樣 理 解 在 中 藥 提 取 活 性 成 分 時 要 把 握 好 藥 材的 采 收 時 間 ？4、 為 保 證 無 菌 ， 操 作 時 有 哪 些 注 意 事 項 ？六 、 思 考 題 結(jié) 束結(jié) 束結(jié) 束