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ELISA方法在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用 來(lái)源：www.nearlw.com 　　1. ELISA的基本原理ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合的一種具有高特異性和高敏感性的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，幾乎所有的可溶性抗原一抗體系統(tǒng)均可用以檢測(cè)，它的最小可測(cè)值達(dá)ng甚至pg水平。該方法的基本原理如下：(1)將抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體(目前以聚苯乙烯微量滴定板最為常用)表面，并保持其免疫活性。 　　此步驟稱為“固相載體的包被”，在商品化試劑盒中均已完成。(2)再將抗原或抗體與某種酶(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等)連接成酶標(biāo)抗原或酶標(biāo)抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。檢測(cè)時(shí)，按相應(yīng)順序加入待檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或酶標(biāo)抗體，使其與固相載體上的抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)。以洗滌的方法洗去各步驟中過量的未結(jié)合物質(zhì)，結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。(3)最后加入酶反應(yīng)的底物，底物即被酶催化生成有色產(chǎn)物，而有色產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定量分析。此種顯色反應(yīng)可通過酶標(biāo)儀進(jìn)行定量測(cè)定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來(lái)，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測(cè)方法。 　　2. ELISA技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用ELISA步驟復(fù)雜，試劑制備困難，只有應(yīng)用符合要求的試劑和標(biāo)準(zhǔn)化的操作，才能獲得滿意的結(jié)果。目前應(yīng)用較廣的檢測(cè)項(xiàng)目一般均有試劑盒出售，完整的ELISA試劑盒應(yīng)包含已包被好的固相載體、酶結(jié)合物、底物和各種濃縮的稀釋液、緩沖液等。 　　在醫(yī)學(xué)研究中，ELISA試劑檢測(cè)的項(xiàng)目主要可分為以下幾類：(1)各種病原體及其抗體的檢測(cè)：如肝炎病毒、巨細(xì)胞病毒、風(fēng)疹病毒、皰疹病毒、艾滋病病毒等；(2)蛋白質(zhì)：腫瘤標(biāo)志物如甲胎蛋白、癌胚抗原等；激素如HCG、FSH、TSH等；細(xì)胞因子如TNF．0l、VEGF、NFKB等；載脂蛋白如Apo A—I、ApoE等；(3)非肽類激素：如T3、rr4、雌二醇、皮質(zhì)醇等；(4)檢測(cè)血液中的藥物濃度：如治療心臟病的藥物地高辛、抗癲癇藥物茶堿、抗生素慶大霉素等 。 　　用于基礎(chǔ)研究的標(biāo)本來(lái)源多種多樣，如臨床血液標(biāo)本，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液標(biāo)本，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織標(biāo)本，培養(yǎng)的細(xì)胞以及細(xì)胞培養(yǎng)上清等，均可作為待測(cè)樣本用于檢測(cè)其中某種物質(zhì)的含量。具體應(yīng)選取何種樣本進(jìn)行特定指標(biāo)的檢測(cè)，取決于實(shí)驗(yàn)研究的目的以及待測(cè)物質(zhì)的表達(dá)特性。 　　3. ELISA在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用特點(diǎn)ELISA方法在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用與其在臨床檢驗(yàn)工作中具有很大不同，區(qū)別之處主要如下：(1)基礎(chǔ)研究中ELISA檢測(cè)所用標(biāo)本來(lái)源廣泛，涉及人、大鼠、小鼠、兔、豬、犬等多種常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬的血液、組織、細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清液等，而臨床檢驗(yàn)所用標(biāo)本則以人的血液(血清或血漿)和尿液等為主；(2)基礎(chǔ)研究具有探索性，其結(jié)果也具有不確定性，沒有正常值范圍而言，需要根據(jù)ELISA檢測(cè)指標(biāo)的具體數(shù)值判斷不同實(shí)驗(yàn)組間樣品測(cè)定值的意義；而臨床檢驗(yàn)的ELISA檢測(cè)結(jié)果具有陽(yáng)性或陰性的界定，或者存在正常值范圍作為判讀測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。(3)對(duì)于臨床檢驗(yàn)標(biāo)本如血清和血漿而言，各種指標(biāo)的ELISA檢測(cè)試劑盒均會(huì)給出對(duì)待測(cè)樣品的最佳稀釋倍數(shù)；而在基礎(chǔ)研究中，尤其當(dāng)所測(cè)指標(biāo)是在組織中表達(dá)時(shí)，即待測(cè)樣品來(lái)源于組織時(shí)，ELISA檢測(cè)試劑盒通常不會(huì)推薦對(duì)待測(cè)樣品的稀釋倍數(shù)；此時(shí)，研究者必須先通過預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出一個(gè)最佳稀釋倍數(shù)之后再進(jìn)行檢測(cè)，因此，對(duì)組織樣本的檢測(cè)步驟較為復(fù)雜和繁瑣。 　　4. ELISA的分類及主要操作流程ELISA方法既可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。根據(jù)樣本中待測(cè)物質(zhì)的種類及性質(zhì)不同，可以設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。臨床檢驗(yàn)工作中用到的ELISA方法主要分為以下幾種類型：(1)用于檢測(cè)抗原的：雙抗體夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法；(2)用于檢測(cè)抗體的：雙抗原夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法及捕獲包被法等。然而，在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中，涉及到的檢測(cè)指標(biāo)大多數(shù)為抗原性物質(zhì)，因此，下文僅就雙抗體夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法這兩種測(cè)定抗原性物質(zhì)的方法進(jìn)行詳細(xì)說明。 　　4．1 雙抗體夾心法檢測(cè)抗原研究表明，充血性心力衰竭患者循環(huán)及組織中自介素一6(inter—leukin-6，IL-6)升高，持續(xù)過度的IL-6產(chǎn)生會(huì)破壞細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)并可能導(dǎo)致心肌損傷及功能障礙的進(jìn)展，因此，循環(huán)IL-6水平與左室功能障礙的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。在此，以檢測(cè)大鼠血漿IL-6為例說明雙抗體夾心法的ELISA操作步驟和要點(diǎn)。 　　4．1．1 操作流程(1)取出試劑盒，置室溫平衡30min；(2)按照說明書要求配制各種工作液：洗液、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液及樣品稀釋液等；(3)根據(jù)說明書推薦的樣品稀釋度對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行稀釋，同時(shí)按照說明書要求配制各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(從空白對(duì)照至低濃度一直到高濃度共設(shè)8個(gè)濃度梯度)；(4)加標(biāo)準(zhǔn)品和樣品：分別在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品各50 L／孔，貼上封板膜，室溫孵育2h；(5)洗板：棄去孔內(nèi)液體，在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干，每孔加洗液3001~L，每次浸泡1 min，共如此重復(fù)洗4次；(6)加酶標(biāo)記的抗體：每孔加酶標(biāo)記抗體100IzL，室溫孵育2h；在此孵育等待期間打開酶標(biāo)儀，預(yù)先建立相應(yīng)的檢測(cè)程序；(7)洗板：重復(fù)(5)中的步驟；(8)加酶的底物：每孔加lOOp,L酶底物溶液，室溫避光孵育30 min(30 min內(nèi)，肉眼觀察可見標(biāo)準(zhǔn)品孔從低濃度至高濃度的淡藍(lán)色逐漸加深，至高濃度的34孔呈現(xiàn)明顯的梯度藍(lán)色，而低濃度的3～4孔梯度不明顯時(shí)，即可終止)；(9)終止反應(yīng)：每孔加100mL終止液，此時(shí)藍(lán)色立即轉(zhuǎn)為黃色；(10)讀數(shù)：加終止液后10—15rain以內(nèi)在酶標(biāo)儀的450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度值(使用步驟(6)中預(yù)先建立的檢測(cè)程序)。 　　4．1．2 雙抗體夾心法檢測(cè)大鼠血漿IL-6的標(biāo)準(zhǔn)曲線在多功能酶標(biāo)儀(所用儀器：TECAN，GENios plus)中的檢測(cè)程序設(shè)定步驟中，可以詳細(xì)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線上各點(diǎn)的濃度數(shù)值和樣品的稀釋倍數(shù)，因此，在最終輸出檢測(cè)數(shù)據(jù)時(shí)，程序軟件能夠根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線上各點(diǎn)的OD值及其對(duì)應(yīng)的濃度，將樣品的OD值自動(dòng)轉(zhuǎn)換計(jì)算出相應(yīng)的濃度，檢測(cè)便捷、直觀且結(jié)果準(zhǔn)確。 　　4．2 競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗原性物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗原的步驟與雙抗體法大致相似，不同之處如下：雙抗體夾心法檢測(cè)抗原時(shí)，先加入待檢樣品使之與固相載體上包被的抗體進(jìn)行反應(yīng)，完成特異性結(jié)合反應(yīng)后洗去未結(jié)合的抗原，然后加入酶標(biāo)記的第二抗體，使之與固相載體上的抗原繼續(xù)反應(yīng)形成夾心式復(fù)合物，對(duì)該夾心復(fù)合物上的標(biāo)記物進(jìn)行測(cè)定，即可得到待測(cè)樣品中抗原的含量；而在競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗原的過程中，是將待檢樣品和一定量的標(biāo)記抗原同時(shí)加入，使二者與固相載體表面有限的抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，反應(yīng)一段時(shí)間后洗去游離的抗原，由于競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的結(jié)果，使結(jié)合在固相載體上的標(biāo)記物的量與樣品中抗原的量成反比，由此可測(cè)定樣品中抗原的含量。 　　Apo A—I占高密度脂蛋白(HDL)的67％ ，能促進(jìn)高密度脂蛋白的成熟 。 　　4．3 雙抗體夾心法與競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗原的主要區(qū)別(1)雙抗體夾心法適用于檢測(cè)蛋白質(zhì)等大分子抗原，一般選擇兩個(gè)針對(duì)抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶標(biāo)記抗體。而小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，不能形成兩位點(diǎn)夾心，故通常選擇競(jìng)爭(zhēng)法模式檢測(cè)。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的特點(diǎn)不同。在雙抗體夾心法中，結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗原(或抗體)的量成正比，因此，樣品的吸光度值(OD值)與濃度呈正比，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。然而，在競(jìng)爭(zhēng)法中，標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，也就是說，標(biāo)本中抗原含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。因此，樣品的吸光度值(OD值)與濃度呈反比。 　　5. ELISA試驗(yàn)的注意事項(xiàng) 　　5．1 如何訂購(gòu)試劑盒目前用于基礎(chǔ)研究的EL1SA試劑盒有別于臨床檢驗(yàn)所用試劑盒，不可用于醫(yī)學(xué)診斷，而僅能用于研究。當(dāng)確定了待測(cè)指標(biāo)后，需要根據(jù)樣本的種屬來(lái)源購(gòu)買相應(yīng)種類的試劑盒。 　　然后，根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量計(jì)算所需試劑盒的數(shù)量。以最為常用的96孔酶標(biāo)板為例，每塊板均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線，一般情況標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)6至8個(gè)不同的濃度值，若按照8個(gè)點(diǎn)計(jì)算，每個(gè)樣品均需做復(fù)孔，則每塊板可以檢測(cè)的樣品數(shù)量最多為40個(gè)。 　　用待測(cè)樣品數(shù)量除以40即是所需購(gòu)買試劑盒的數(shù)量。在訂購(gòu)ELISA試劑盒之前還要注意一點(diǎn)：某些試劑盒說明書中要求樣品的前期處理必須使用同一公司生產(chǎn)的特定配套試劑，因此，如果測(cè)定組織中某個(gè)指標(biāo)的含量時(shí)，需要用到相應(yīng)的組織蛋白提取試劑及蛋白濃度檢測(cè)試劑，這種情況下，應(yīng)盡量按照說明書要求提前將所有相關(guān)試劑購(gòu)買完全，以免延誤實(shí)驗(yàn)。 　　5．2試劑盒在使用前需要先從冰箱中取出，在室溫平衡30min左右再用于檢測(cè)。 　　5．3 標(biāo)本的采集與保存采集血清樣品時(shí)，需將全血標(biāo)本于室溫放置2h或4℃過夜后，離心分離出上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜赺20~C或以下保存以備用。為避免反復(fù)凍融導(dǎo)致血清中待測(cè)物質(zhì)降解，需適量分裝血清后再凍存。若需用血漿樣品進(jìn)行ELISA檢測(cè)，則可將抗凝劑(如EDTA、肝素或枸櫞酸鈉等)加入血液標(biāo)本，在30min內(nèi)離心分離上清檢測(cè)或分裝凍存?zhèn)溆?。?duì)于細(xì)胞培養(yǎng)上清，需要在1000rpm離心5min，取上清用于檢測(cè)，目的是為了去除混懸在其中的漂浮細(xì)胞。進(jìn)行ELISA測(cè)定之前，需要按照相應(yīng)說明書要求，對(duì)樣品進(jìn)行稀釋之后用于檢測(cè)。 　　5．4 樣品的稀釋倍數(shù)當(dāng)待測(cè)樣品為血清或血漿時(shí)，ELISA檢測(cè)試劑說明書通常會(huì)給出建議的稀釋倍數(shù)，便于操作。較為復(fù)雜和繁瑣的情況是檢測(cè)組織樣本中某種物質(zhì)的定量表達(dá)。任何ELISA試劑說明書都不會(huì)說明一個(gè)關(guān)鍵的問題，那就是：從組織樣本中提取蛋白之后，以多大倍數(shù)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋后最適宜檢測(cè)? 　　因?yàn)榇郎y(cè)物質(zhì)在不同組織中的表達(dá)豐度可能不一樣；同時(shí)，對(duì)于不同的研究者而言，即便用同種組織進(jìn)行檢測(cè)，如果對(duì)組織的勻漿或裂解的程度不同的話，所提取的蛋白濃度自然就不相同，因此，對(duì)樣品的稀釋倍數(shù)就會(huì)存在差異。這種情況下，研究者必須首先提取組織蛋白上清，并測(cè)定出蛋白濃度，然后結(jié)合文獻(xiàn)所報(bào)道的待測(cè)物質(zhì)在該組織中的濃度值(一般為每克組織蛋白中所含待測(cè)物質(zhì)的質(zhì)量)，對(duì)蛋白上清的稀釋倍數(shù)進(jìn)行估算。然后在此估算的稀釋倍數(shù)基礎(chǔ)上，還需要以該稀釋倍數(shù)為中心，另設(shè)2—3個(gè)稀釋度，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出最佳稀釋倍數(shù)，最后再進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。 　　5．5 抗凝劑的選擇對(duì)于某些特殊的檢測(cè)指標(biāo)，為了使測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，需要了解相關(guān)的知識(shí)。例如，用血漿樣品進(jìn)行脂蛋白分析時(shí)，需要注意抗凝劑的選擇。由于枸櫞酸鈉和氟化鈉等低分子量抗凝劑的低滲效應(yīng)，使得大量水分子進(jìn)入血漿造成血漿成分的稀釋。而二價(jià)陽(yáng)離子螯合劑EDTA，因其分子量較大，產(chǎn)生的低滲效應(yīng)小，對(duì)血漿蛋白濃度影響很小，僅降低3％或4％ ；肝素比EDTA的分子量更大，其在產(chǎn)生抗凝作用的濃度時(shí)未檢測(cè)到對(duì)血漿的稀釋效應(yīng)。因此，EDTA和肝素均可用作脂蛋白分析研究的抗凝劑；同時(shí)，由于EDTA能抑制在血漿凍存過程中發(fā)生的氧化反應(yīng)和酶組分的改變，故在實(shí)際操作中ED—TA是最常用的抗凝劑。用于基礎(chǔ)研究的ELISA試劑盒，在說明書中一般都會(huì)推薦該檢測(cè)指標(biāo)需使用的抗凝劑，取血液標(biāo)本之前要注意查看。 　　5．6 其他需要準(zhǔn)備的儀器及耗材除了酶標(biāo)儀之外，還用到的儀器有酶標(biāo)板專用控溫?fù)u床、37~C孵箱和漩渦混勻器等，需根據(jù)不同試劑盒操作要求而選擇使用。此外，各個(gè)量程的移液器、一次性吸頭、吸水紙、乳膠手套、燒杯和量筒、去離子水、冰盒、試管及離心管等。在檢測(cè)開始之前應(yīng)準(zhǔn)備好以上所有物品放置于手邊，以使檢測(cè)過程順利進(jìn)行。 　　5．7 ELISA操作要點(diǎn)在ELISA操作中有以下幾個(gè)步驟較為關(guān)鍵：(1)加樣：加樣要準(zhǔn)確，試劑應(yīng)垂直滴加，不得傾斜、人為的加大試劑量。 　　使用一次性吸頭，防止交叉污染。定期校準(zhǔn)加樣器。標(biāo)本應(yīng)加在微孔底部，避免加在孔壁上部，并注意不要濺出及產(chǎn)生氣泡。(2)溫育：96孔酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)特別，易產(chǎn)生邊緣效應(yīng)，抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對(duì)溫度有嚴(yán)格要求，酶標(biāo)板周圍孔與內(nèi)部孔的升降溫速率不同，造成周邊與內(nèi)部孔結(jié)果有差異。因此，溫育過程中應(yīng)該用封板膜封閉整塊板，盡量避免邊緣效應(yīng)的產(chǎn)生。溫箱溫度必須嚴(yán)格控制，溫育時(shí)間也應(yīng)按說明書規(guī)定力求準(zhǔn)確。(3)洗板：冼滌是ELISA操作的重要環(huán)節(jié)，手洗條件一致性較差，對(duì)結(jié)果影響較大，半自動(dòng)與全自動(dòng)洗板機(jī)使用不當(dāng)也會(huì)影響結(jié)果。洗滌時(shí)確認(rèn)洗液注滿每個(gè)板孔，但不可溢出板孔，棄液后將孔內(nèi)液體在吸水紙上拍干。為了洗滌效果更好，實(shí)驗(yàn)室可采用機(jī)器與人工洗滌相結(jié)合的方法，在機(jī)器洗滌后再進(jìn)行人工洗板1-2次，或適當(dāng)增加洗板的次數(shù)。 　　(4)顯色終止：顯色時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格按說明書的規(guī)定。應(yīng)在顯色終止15min內(nèi)進(jìn)行酶標(biāo)儀讀取。 　　5．8 使用全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀建立檢測(cè)程序針對(duì)具體檢測(cè)指標(biāo)而言，使用酶標(biāo)儀及其相關(guān)軟件設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品的濃度、樣品的數(shù)量、樣品的稀釋倍數(shù)、樣品的排布及數(shù)據(jù)輸出格式等條件，在顯色反應(yīng)終止之前預(yù)先建立好檢測(cè)程序。待顯色終止后，即可將反應(yīng)板放置于酶標(biāo)儀中，打開檢測(cè)程序進(jìn)行讀數(shù)，接著可通過連接的打印機(jī)立即打印結(jié)果，操作簡(jiǎn)便、快捷。 　　綜上所述，盡管ELISA法操作簡(jiǎn)便，但影響測(cè)定結(jié)果的因素較多，因此，在實(shí)際操作過程中，需要加強(qiáng)質(zhì)量管理，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。全自動(dòng)酶標(biāo)儀的應(yīng)用，可實(shí)現(xiàn)ELISA標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)，以避免或減少相關(guān)因素的影響，力求結(jié)果準(zhǔn)確，為醫(yī)學(xué)科學(xué)研究提供可靠的依據(jù)。