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第四章 蛋白質的物理化學性質,1,重點與難點,熱力學相關函數(shù)：熵、焓、熱容量 蛋白質折疊相關作用力 蛋白質的折疊過程,2,第一節(jié) 熱力學函數(shù)與蛋白質構象,3,一、熱力學函數(shù)與熱力學平衡,·內能：組成物體的所有分子的無規(guī)則運動的動能與分子間相互作用的勢能之和。,4,焓(enthalpy)：是一個系統(tǒng)的熱力學參數(shù)。,它描述的是體系的一個狀態(tài)性質，焓的變化是系統(tǒng)在等壓可逆過程中所吸收的熱量的度量。用符號H表示，即 H=E+pV E為系統(tǒng)內能，p為其壓強，V則為體積,5,熵（S）是度量體系混亂度的熱力學函數(shù) 從微觀的角度來看，熵具有統(tǒng)計意義，它是體系微觀狀態(tài)數(shù)(或無序程度)的一種量度。 熵值小，對應比較有秩序的狀態(tài) 熵值大，對應比較無秩序的狀態(tài),6,內能(E)和焓(H)是體系自身的性質，要認識它們，需憑借體系和環(huán)境間熱量和功的交換從外界的變化來推斷體系E和H的變化值。 熵也是如此，體系在一定狀態(tài)下有一定的值，當體系發(fā)生變化時要用可逆變化過程中的熱溫熵來衡量它的變化值。,7,?吉布斯自由能(Gibbs free energy,G):亦稱吉布斯函數(shù)，它是定溫定壓下系統(tǒng)的狀態(tài)函數(shù)?？梢杂霉奖硎緸椋?G=H-TS=E+pV-TS 其中，T為絕對溫度；S為體系的熵 注意:吉布斯自由能是體系的性質，它的大小只決定于體系的始態(tài)和終態(tài)，而與變化的途徑無關(即與可逆與否無關)。,8,二、熱容量,熱容量:指系統(tǒng)在某一過程中，溫度升高（或降低）1℃所吸收（或放出）的熱量。熱容量的單位是J/K。 系統(tǒng)的熱容量與狀態(tài)的轉變過程有關，與它所包含的物質的質量成正比，不同過程的熱容量不同。 系統(tǒng)吸收的熱量為正值，釋放的熱量為負值 使用微分掃描量熱儀直接測定熱容量變化,9,三、van’t Hoff 焓,? Van’t Hoff 規(guī)則 ：荷蘭科學家范特霍夫 提出, 溫度每升高10 K, 反應速度增加2-4倍,,,10,當溶液中的活性狀態(tài)N與失活狀態(tài)U處于平衡時，平衡常數(shù)K=[U]/[ N] 取決于兩種自由能之差?G=GU－GN 。 自有能差?G也可以用焓差?H=HU－HN和 熵差?S=SU－SN 表示為： ?G = ?H－T?S 于是： －RT·lnK = ?H0－T?S0 由此看出，平衡常數(shù)對溫度的依賴關系可以用來估計?H的大小。H0和S0 分別表示標準狀態(tài)下的焓和熵。 所以 lnK = －?H0/ RT+?S0/R 即 lnK =（－?H0/ R）（1/T）+?S0/R,11,以lnK的實驗值對1/T作圖，可以得到一條直線，這條線上任何點上的斜率為 Van't Hoff焓（△H0）與R之比。,Van’t Hoff焓主要用于兩態(tài)轉變模型的分析,12,四、蛋白質構象與熱運動,構象:由于單鍵基本自由旋轉以及鍵角有一定的柔性，一種具有相同結構和構型的分子在空間里可采取多種形態(tài)，分子所采取的特定形態(tài)稱為構象。 構象角:圍繞單鍵旋轉的角度稱為構象角,它決定了多肽鏈的一個結構 。,13,熱運動:是指蛋白質溶液中所有分子的不停運動，包括了分子相對于容器的運動和分子內部各部分之間的相對運動。 熱運動在溶液中和多肽鏈的各部分之間傳播，主要是通過多肽鏈各部分之間和多肽鏈與溶液分子之間的相互作用來實現(xiàn)的。 體系達到熱力學平衡時，在空間的一定范圍內和一定間隔內的平均熱運動能量不再發(fā)生變化，蛋白質處于天然態(tài) 。,14,五、熱力學參數(shù)在分子水平上的解釋,從分子的相互作用來理解蛋白質天然結構的穩(wěn)定性 為了使蛋白質折疊起來，就需要通過多肽鏈各部分間相互作用所引起的內能的減少來抵消構象熵減少帶來的自由能增加。,G=H-TS=E+pV-TS,15,熵是水溶液中形成疏水基團間結合的主要熱動力學驅動力。,穩(wěn)定蛋白質三維結構的作用力：氫鍵、范德華力、疏水作用力和鹽鍵（離子鍵）及共價二硫鍵。,16,1．靜電相互作用,蛋白質的折疊態(tài)與退折疊態(tài)的空間結構不同，在水溶液中，表現(xiàn)為同一個可電離基團附近環(huán)境的有效介電常數(shù)的變化，于是它們的pka值也不同。 殘基pka值的移動很小，但蛋白質大分子可電離集團相當多，小pka值移動的大量積累對蛋白質穩(wěn)定性很重要。 靜電相互作用對折疊穩(wěn)定性潛在的重要性,17,2．范德華相互作用,范德華力（van der Waals interaction） 在物質的聚集態(tài)中，分子間存在著一種較弱的吸引力，當兩個不帶電荷的原子非?？拷鼤r，它們的電子云相互作用，核周圍電子位置的隨機變化可能產生一個瞬間電偶。該電偶能夠誘導鄰近的原子產生一個短暫的反向電偶。這兩個電偶之間會產生微弱的引力,從而拉近兩個原子核。這種微弱的吸引力即為范德華力 。,18,范德華力組成： 取向力 :當極性分子相互接近時，它們的固有偶極將同 極相斥而異極相吸，定向排列，產生分子間的作用力 誘導力 :當極性分子與非極性分子相互接近時，非極性分子在 極性分子的固有偶極作用下，發(fā)生極化，產生誘導偶 極，然后誘導偶極與固有偶極相互吸引而產生分子間作 用力 色散力 :非極性分子之間，由于組成分子的正、負微粒不斷運 動，產生瞬間正、負電荷重心不重合，而出現(xiàn)瞬時偶 極。瞬時偶極之間的相互作用力 。,19,3.氫鍵（Hydrogen Bonding）,由電負性原子與氫形成的基團如（N-H和O-H）具有很大的偶極矩，成鍵電子云分布偏向負電性大的原子，因此氫原子核周圍的電子分布就少，正電荷的氫核(質子)就在外側裸露。這一正電荷氫核遇到另一個電負性強的原子時，就產生靜電吸引，即氫鍵。,20,,在生物相中最常見的氫鍵是羥基（-OH）和氨基（-NH）之間，其穩(wěn)定性遞減次序大約是OHNXONHN-NHO，這種鍵可以發(fā)生在分子間、分子內或者二者的結合。,21,氫鍵對蛋白質天然結構的穩(wěn)定作用只能來自于水-水氫鍵+鏈內氫鍵，和水-肽鏈氫鍵兩種情況下的自由能之差。蛋白質中有許多種氫鍵。,22,氫鍵在蛋白折疊過程中的作用,杜克大學（Duke University）的化學家們通過改變蛋白質關鍵部位的單個原子，發(fā)現(xiàn)了相對作用力較弱的氫鍵在使線形蛋白折疊成能發(fā)揮生物活性的最穩(wěn)定結構中有重要作用,PANS,2006,23,4.疏水效應（hydrophobic effect）,疏水效應:水介質中球狀蛋白質的折疊總是傾向于把疏水殘基埋藏在分子的內部。 蛋白質溶液系統(tǒng)的熵增加（熵變化?S為正值）是疏水作用的主要動力。,24,疏水作用是疏水基團或疏水側鏈出自避開水的需要而被迫接近。要使疏水氨基酸R基團排除水而埋在內部，至少需要兩層二級結構。兩種簡單形式，β-α-β環(huán)（β-α-βloop）和α-α角（α-αcorner）。,25,,A,B,吲哚與苯環(huán)邊對面T型接觸,惡唑環(huán)與苯環(huán)面對面平行接觸,疏水作用的方向傾斜性實例圖,26,5.二硫鍵,二硫鍵(共價鍵) 為了確定蛋白質的一級結構，須在2-巰基乙醇、二硫蘇糖類、巰基乙酸等硫化合物與尿素等變性劑同時存在下將二硫鍵打開 RNA酶復性實驗發(fā)現(xiàn)二硫鍵對肽鏈的正確折疊不是必要的，但它對穩(wěn)定折疊態(tài)結構作出貢獻。,27,6.鹽橋或離子鍵,鹽橋或離子鍵又稱鹽鍵，它是正電荷與負電荷之間的一種靜電相互作用。 鹽鍵的形成既是靜電相互作用的過程也是熵增的結果。,28,第二節(jié) 突變、穩(wěn)定性和折疊,一、體外突變技術 概念:體外突變技術是用酶學方法和化學方法剪切或合成DNA ，將突變導入到克隆化的基因中，再將改變的基因重新克隆到生物體中分析該基因的功能變化的一項技術。 分類: 隨機突變 定點突變 3.應用:研究蛋白質結構和功能之間的復雜關系 。,29,4.具體事例： 改進α-抗胰蛋白酶 α-抗胰蛋白酶與嗜中性白細胞彈性硬蛋白酶結合形成復合物,將后者在Met358和Ser359之間切斷,30,,提高重組干擾素的專一活性 β- IFN 基因在E.coli中表達,產物的抗病毒活性為天然糖基化蛋白的10% 3個Cys Cys31-Cys141 Cys17 Ser17,,31,提高T4溶菌酶的熱穩(wěn)定性,T4 溶菌酶(Cys54 -Cys97) Ile3 Cys3 -Cys97 熱穩(wěn)定性 Cys21 Cys142 穩(wěn)定性 酶活性,,,,,,,,32,磷酸丙糖異構酶的結構改造提高其穩(wěn)定性,高溫：Asn Asp Gln Glu 失活 Asn14 、Asn78 Thr或Ile 熱穩(wěn)定性,,,,,33,二、突變與熱穩(wěn)定性,,,,1.定點突變對蛋白質穩(wěn)定性的影響 氨基酸的插入和刪除、寡聚化和脯氨酸取代這三因素可以穩(wěn)定個別嗜熱蛋白。 2.導致熱穩(wěn)定性的因素 堆積、寡聚化、氨基酸插入和刪除、脯氨酸取代、螺旋含量、螺旋傾向、極性表面積、氫鍵和鹽橋 3.突變試驗增加蛋白質的親鹽性 例如親鹽的蘋果酸脫氫酶中的唯一的Glu替換為Arg,34,三、蛋白質折疊,1 . 蛋白質折疊研究的概況 ※蛋白質折疊:蛋白質的一級結構并沒有生物活性，結構決定功能，一維的線型氨基酸序列轉化為具有特征三維結構的天然蛋白質才具有生物活性，這種自我組裝的過程被稱為蛋白質折疊。 ※追蹤蛋白質重折疊的全過程的實驗方法： 快速核磁共振，快速光譜技術（熒光、圓二色譜）,35,※蛋白質折疊技術的研究應當將蛋白質結構研究與折疊過程動力學研究相結合以促進對蛋白質折疊機理的認識。 ※“新生肽的折疊”問題與中心法則,36,2．蛋白質折疊機制,※Anfinsen經(jīng)典的“熱力學假說” 天然蛋白質多肽鏈采取的構象是在一定環(huán)境條件下熱力學上最穩(wěn)定的結果，采取天然構象的多肽鏈和它所處的一定環(huán)境條件整個系統(tǒng)的總自由能最低。蛋白質多肽鏈折疊的過程，也就是從眾多可能的構象中尋找系統(tǒng)自由能最低的狀態(tài)的過程。,37,Wolynes提出粗糙能量地形面的觀點,即折疊是在一個折疊漏斗中進行的。蛋白質折疊的過程就象多溪流水從具有復雜地形結構的山坡流下一樣，而不僅是一溪流水從一單個山谷中流下。 折疊的能量漏斗模型形象地描繪了折疊過程的多路徑性,圖 能量漏斗模型,38,蛋白質折疊過程假設,※ 肽鏈中的局部肽段先形成一些構象單元即α螺旋、β折疊和β轉角等二級結構，然后再是二級結構的組合、排列形成蛋白質的三級結構。 ※ 首先是肽鏈內部的疏水作用起作用，產生一個塌陷過程，然后經(jīng)調整，形成不同層次的結構。,39,不同的假設，都有一個所謂“熔球態(tài)”的中間狀態(tài),※ 熔球體：在折疊中，第一個可觀測到的中間體是未折疊多肽卷折成局部有組織的球狀態(tài)。,40,※分子伴侶與蛋白質折疊 分子伴侶的功能 (1)可調節(jié)性地阻礙多肽鏈集聚 (2)具有折疊互補功能,即可使已形成的蛋白質集聚體重折疊和恢復其水溶性 (3)可以促進折疊錯誤的蛋白質降解,41,,“有幫助的肽鏈的自發(fā)折疊和組裝”,42,3.蛋白質折疊研究的最新進展,巴西圣保羅州立大學,美國紐約州立石溪大學,以及中科院長春應用化學研究所電分析化學國家重點實驗室的研究人員在之前研究的基礎上發(fā)現(xiàn)了擴散(diffusion)在蛋白折疊動力學方面的重要作用。 擴散系數(shù)隨著蛋白質天然狀態(tài)折疊級數(shù)的增加而減小，這主要是由于構造空間約束的一種緊密狀態(tài)的塌陷造成的。它改變折疊動力學的比率和動力學路徑。,PNAS,43,,美國康奈爾大學和Scripps Research Institute的研究者發(fā)現(xiàn)：沿著肽鏈具有很多疏水基團依賴自身折疊的位點，生成了小型的非極性疏水袋，蛋白質沿著包含有非極性基團或者含有不帶電荷分子的氨基酸鏈處開始折疊，并通過這些非極性基團的組合進一步折疊。,PNAS，2006,44,4.蛋白質折疊研究意義及應用前景,※蛋白質折疊研究意義 蛋白質折疊機制的闡明有助于揭示生命體內第二套遺傳密碼的理論意義。 最終闡明遺傳信息傳遞的全過程，完全建立分子生物學的中心法則。,45,應用前景,（1）對包涵體的復性有重要幫助 （2）DNA重組和多肽合成技術的發(fā)展使我們能夠按照自己的意愿設計較長的多肽鏈 （3）深入了解蛋白質折疊與錯誤折疊的關系對于這些疾病的致病機制的闡明以及治療方法的尋找將大有幫助 （4）蛋白質折疊機制的闡明是我們對于蛋白質相互作用、配體與蛋白質的作用等結構與功能關系研究的基礎 （5）提高蛋白質結構預測的可靠性,46,第三節(jié) 蛋白質折疊熱力學與動力學,蛋白質折疊內容： （1）變性的蛋白質或多肽鏈的折疊 （2）通過三聯(lián)密碼翻譯成的氨基酸序列鏈(新生肽鏈) 的折疊 蛋白質折疊的研究方法 （1）X-射線晶體衍射 （2）同源模建方法 （3）從蛋白質序列出發(fā)，直接預測蛋白質的結構？,47,一、蛋白質折疊的熱力學研究,Anfinsen認為,蛋白質的折疊結構在一定條件下是熱力學最穩(wěn)定的,即通常的自由能極小的狀態(tài)。 環(huán)境條件不同，熱力學平衡移動的方向就不同，可以向天然態(tài)方向移動，也可以向退折疊方向移動，就有了平衡態(tài)的折疊和退折疊轉變過程。 通過熵函數(shù)和吉布斯自由能,簡要分析蛋白質折疊結構中所蘊涵的熱力學基本原理,48,蛋白質折疊研究的漏斗模型,49,1.熵效應,熵增加原理：在絕熱條件下，體系發(fā)生不可逆過程時，其熵值增大；而體系發(fā)生可逆過程時，其熵值不變；不可能發(fā)生熵值減小的過程。 疏水作用的主要動力來自于蛋白質溶液體系的熵增效應。 例如,疏水作用是肌紅蛋白多肽鏈折疊的主要驅動力, 使水介質中球狀蛋白質的折疊總是傾向于把疏水殘基隱藏在分子的內部，其在穩(wěn)定蛋白質的三維結構方面占有突出的地位。,50,2.吉布斯自由能變化,※ ΔG總=ΔH鏈+ΔH溶劑- TΔS鏈- TΔS溶劑 ※ 折疊態(tài)蛋白質與伸展態(tài)相比，是一種高度有序化的結構，因此ΔS鏈是負數(shù)，則-TΔS鏈為正值。 ※ 折疊態(tài)蛋白質中疏水側鏈主要是通過范德華力彼此相互作用。 ※ 對于典型的蛋白質來說，對折疊結構的穩(wěn)定性做出單項最大貢獻的是疏水殘基引起的ΔS溶劑。,51,3．折疊/退折疊轉變,蛋白質折疊歸根結底取決于在某溫度（T）下折疊態(tài)（F）和伸展態(tài)（U）之間的吉布斯自由能差（△G）： ΔG=GF－GU=ΔH－TΔS=（HF－HU）－T（SF－SU） 在伸展態(tài)中多肽主鏈及其側鏈是與溶劑水（也稱介質水或環(huán)境水）相互作用的，因此折疊時自由能變化（△G）的任何測量必須考慮多肽鏈和溶劑兩者對焓變化（△H）和熵變化（△S）的貢獻： ΔG總=ΔH鏈＋ΔH溶劑－TΔS鏈－TΔS溶劑 極性側鏈?H鏈是正值，而?H溶劑是負值。對蛋白質的極性側鏈來說，?G總接近于零，對蛋白質折疊不作實質性的貢獻。,52,幾種蛋白質折疊的熱力學數(shù)據(jù),※ 在不同蛋白質中總熵變化（ΔS鏈+ΔS溶劑）和總焓變化對折疊結構的穩(wěn)定性所做的貢獻的份額是不同的,53,,折疊結構在生理條件下是自由能最低的構象，因此多肽鏈的折疊是自發(fā)過程。,54,4.量熱法與折疊過程熱力學,量熱試驗是用一種微分掃描量熱儀直接測定熱容量的變化，還可以測定焓變、熵變。,N,U,55,二、蛋白質折疊的動力學研究,,※ 蛋白質折疊 線性多肽鏈的一級結構最終形成具有三維 結構特征并表現(xiàn)其生物學功能的天然蛋白質的 復雜過程。 ※ 蛋白質折疊的步驟,56,57,1．折疊動力研究技術與方法,Levinthal puzzle：假定每個氨基酸殘基可能的構象狀態(tài)數(shù)為j，一個有N+1個氨基酸殘基，N個肽單位的完全去折疊蛋白質，其肽鏈可能獲得的構象狀態(tài)數(shù)為j N。 例如j=8,一個有101個氨基酸殘基的較小的蛋白質，其肽鏈的可能構象狀態(tài)為8100（1089） 如果構象之間的轉換速率為k，蛋白分子經(jīng)歷全部構象的平均時間為： τ=（Nk）-1jN 例如：101個氨基酸殘基的蛋白質經(jīng)歷全部構象的時間多于1066年。,58,,蛋白質的折疊不是一個隨機過程，而是通過特定的動力學途徑達到天然構象，即動力學上最容易達到的構象。,59,蛋白質天然構象的形成,60,蛋白質多肽鏈正確折疊原因 某些因素在蛋白質折疊的動力學過程中起控制作用 。 如：I型人類胰島素生長因子（IGF-I） 枯草桿菌蛋白酶(subtilisin) 蛋白質折疊動力學控制的研究基礎----熱力學假說 蛋白質構象的研究方法 測定溶液中的蛋白質分子構象 測定晶體蛋白質分子構象,61,測定蛋白質構象的各種方法,62,2.過渡態(tài),,模擬的折疊過程,過渡態(tài)理論 是否適合于描述蛋白質分子的折疊／退折疊過程 ？,63,3．折疊中間態(tài),(1)熔球態(tài)（molten globule） ※主要特征: ①天然態(tài)二級結構，但三級結構卻不完整； ②它比天然態(tài)有較多的疏水區(qū)域暴露； ③當熔球態(tài)變性到伸展態(tài)時，溫度躍遷消失。 例如Goto等發(fā)現(xiàn)，在強酸導致肽鏈完全伸展時，可以得到β-乳球蛋白（β-Lactoglobulin）、細胞色素c（cytochromec）及去輔基肌紅蛋白（apo-Mb）的熔球態(tài)。,64,※蛋白質正確折疊過程中的阻礙,①部分折疊的中間體在分子間疏水作用下而引起的聚集 ②脯氨酸殘基的異構化 ③半胱氨酸錯誤配對而形成的二硫鍵連接,65,折疊?。?蛋白質分子的氨基酸序列沒有改變，只是其結構或者說構象有所改變也能引起疾病。 瘋牛病 朊病毒：正常蛋白的錯誤折疊形成的致病蛋白-朊病毒蛋白(PrP)在腦組織中累積而引起的,※蛋白質折疊病,66,67,其它常見的折疊病 老年性癡呆癥、囊性纖維病變、家族性高膽固醇癥、家族性淀粉樣蛋白癥、某些腫瘤、白內障等等都是折疊病。,68,（2）快態(tài)與慢態(tài),蛋白質退折疊態(tài)的構象上具有多樣性: 例如牛胰核糖核酸酶在變性條件下發(fā)生退折疊，結果表明，只能觀察到兩種構象—天然態(tài)N和伸展態(tài)U，并且它們處于快速平衡中：,,,,,,,,69,RNase的重折疊快相和慢相的雙相動力學過程,退折疊蛋白質中，脯氨酰異構化是研究得較為清楚的慢反應,70,,,,,,,,,,U,,M,,N,,蛋白質在某些變性條件下還存在平衡中的另一狀態(tài)，如α-乳清蛋白。,71,（3）二硫鍵引起的中間態(tài),二硫鍵異構酶功能 ①具有催化蛋白質天然二硫鍵快速形成的能力 ②特異性較低可與各種不同的肽鏈結合 二硫鍵異構酶作用機制推測 通過與肽段結合阻止了錯誤的折疊途徑,促進生成正確的中間物，幫助肽鏈折疊使相應的巰基配對，從而使正確的二硫鍵得以形成，然后催化巰基的氧化或二硫鍵的異構而形成天然二硫鍵。,72,,巰基／二硫鍵氧化還原酶在二硫鍵生成反應中起著氧化劑的作用 例如： 大腸桿菌中有DsbA和DsbC蛋白，真核細胞中有二硫鍵異構酶,73,4．折疊的基本過程,折疊主要經(jīng)歷以下三種基本過程 ①接觸形成 ②螺旋-鏈環(huán)轉變 ③β發(fā)卡（β-hairpin）：是普遍存在于球狀蛋白中的一種結構，由一條構象伸展的多肽鏈彎曲后彼此靠近成反向平行而形成，含有10或11個氨基酸殘基，兩條等長的肽段依靠1～6個氫鍵連接。,74,謝謝！,75,