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DBS 53 云南省食品安全地方標準 DBS 53/ 016—2013 食品中展青霉素的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 2013 - 10 - 20發(fā)布 2014 - 04 - 20實施 云南省衛(wèi)生廳發(fā)布 DB53/ 016—2013 前言 本標準為首次發(fā)布。 6 食品中展青霉素的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 1　 范圍 本標準適用于食品（果汁飲料、果酒、果醬、果干及薯類制品等）中展青霉素的測定和確證。 2　 規(guī)范性引用文件 本標準中引用的文件對于本標準的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本標準。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標準。 3　 原理 澄清液體樣品（果酒樣品需出去乙醇）直接固相萃取凈化；混濁液體樣品和固體樣品先用果膠酶水解，再以乙酸乙酯提取，吹干濃縮后固相萃取凈化，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定，外標法定量。 4　 試劑 除另有說明外，所用試劑均為分析純，試驗用水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。 4.1　 乙腈（色譜純）。 4.2　 甲醇（色譜純）。 4.3　 冰乙酸。 4.4　 乙酸乙酯（色譜純）。 4.5　 果膠酶溶液：活度不低于1300 U/mL（果膠酶固體則需按活度配制為溶液）。 4.6　 0.2%乙酸溶液：量取2 mL冰乙酸以水定容于1000 mL容量瓶。 4.7　 展青霉素標準品（patulin）：CAS編號149-29-1，純度大于99.0%。 4.8　 展青霉素標準儲備溶液：準確稱取適量的展青霉素標準品，用乙酸乙酯配成200 μg/mL的標準儲備溶液，避光于-18℃下保存，穩(wěn)定期1個月。 4.9　 展青霉素標準中間溶液：準確移取適量的展青霉素標準儲備溶液，用氮氣吹干后，用0.2%乙酸（4.7）配成2 μg/mL的標準中間溶液，避光于4℃下保存，即用即配。 4.10　 標準工作溶液：以相應(yīng)的空白樣品為基質(zhì)，加入相應(yīng)濃度的標準中間液，配制成1.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L標準溶液，同樣品一同進行前處理及上機檢測，并繪制標準曲線。 4.11　 固相萃取小柱：Osais HLB或相當者，3 mL/60 mg。使用前對固相萃取柱依次加入3 mL水、3 mL甲醇和3 mL水活化，流速控制在每秒2滴~3滴。 5　 儀器 5.1　 液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源（ESI）。 5.2　 電子天平：感量0.1 mg，感量0.01 g。 5.3　 漩渦混勻器。 5.4　 高速離心機。 5.5　 攪拌式均質(zhì)機。 5.6　 氮氣吹干儀。 5.7　 恒溫空氣?。ㄋ。┱袷幤鳌? 6　 分析步驟 6.1　 試樣處理 6.1.1　 澄清液體樣品 取2 g試樣（精確到0.01 g）于已活化的固相萃取柱上，用2 mL乙酸溶液（4.6）淋洗，流速為每秒1滴，抽真空3 min~5 min，然后加入乙酸乙酯（4.4）溶液洗脫，收集洗脫液于氮氣下常溫吹干，用1 mL乙酸溶液（4.6）溶解定容，供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。 6.1.2　 濃縮果汁、果醬等渾濁試樣 取4 g試樣（精確到0.01 g）于一具塞離心管中，加入20 mL水以均質(zhì)機充分均質(zhì)，再加入200 μL果膠酶溶液（4.5）混勻，30℃空氣浴（或水?。l件下避光搖震過夜，在酶解后的溶液中加入20 mL乙酸乙酯，漩渦提取3 min，于4000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上層乙酸乙酯提取液，再用20 mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次。合并兩次乙酸乙酯提取液，過無水硫酸鈉后，取20 mL氮吹濃縮至干，用2 mL乙酸溶液（4.6）溶解殘渣并定容。凈化過程同6.1.1。 6.1.3　 固體樣品 取100 g樣品進行粉碎后取4 g試樣（精確到0.01 g）于一具塞離心管中。其余步驟同6.1.2。 6.2　 測定 6.2.1　 液相色譜參考條件 a) 色譜柱：C18填料，規(guī)格：100 mm×2.0 mm×3.0 μm或相當者； b) 流動相：流動相為水和甲醇，流動相梯度見表1。 c) 流速：0.4 mL/min； d) 柱溫：25℃； e) 進樣量：5 μL。 表1　 流動相的梯度洗脫程序 時間/min 0.0 1.0 3.0 4.0 4.1 6 乙腈/% 10 10 60 60 10 10 6.2.2　 質(zhì)譜條件 a) 離子化模式：展青霉素電噴霧電離為負離子模式（ESI-）。 b) 質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。 c) 其他質(zhì)譜條件參見附錄A。 6.3　 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測定 6.3.1　 定量測定 根據(jù)樣液中展青霉素濃度，選定峰面積相近的標準工作溶液，標準工作溶液及樣液中展青霉素響應(yīng)值應(yīng)在儀器檢測線性范圍內(nèi)。在上述儀器條件下，展青霉素參考保留時間約3.18 min。標準溶液的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測譜圖參見附錄B中圖B.1。 6.3.2　 定性測定 按照上述儀器條件測定樣品和標準工作溶液，如果樣品的質(zhì)量色譜峰對保留時間與標準溶液在±2.5%范圍內(nèi)；定性離子對的相對豐度與濃度相當?shù)幕旌匣|(zhì)標準溶液的相對豐度一致，相對豐度偏差不超過表2的規(guī)定，則可判定樣品中存在相應(yīng)的被測物。 表2　 定性測定時相對離子豐度的最大允許偏差 相對離子豐度/% ＞50 ＞20~50 ＞10~20 ≤10 允許的相對偏差/% ±20 ±25 ±30 ±50 6.4　 檢出限 本方法的測定低限：展青霉素為5 μg/kg。 7　 結(jié)果計算 結(jié)果按式(1)計算： (1) 式中： X—試樣中展青霉素含量，單位為微克每千克（μg/kg）； c—從標準工作曲線上得到的被測組分溶液濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）； V —定容體積，單位為毫升（mL）； m —試樣溶液所代表試樣的質(zhì)量，單位為克（g）。 8　 精密度 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對值不得超過算術(shù)平均值的10％。 A A 附　錄　A （資料性附錄） 展青霉素參考質(zhì)譜條件 表A.1　 展青霉素參考質(zhì)譜條件 質(zhì)譜條件 展青霉素 152.9/108.9a 152.9/81.0b 噴霧電壓IS/eV -4500 氣簾氣CUR/MPa 10.0 碰撞氣CAD/MPa 5 去溶劑溫度TEM/℃ 600 霧化氣GS1/MPa 50.0 去溶劑氣流GS2/MPa 50.0 去簇電壓DP/eV -20.0 碰撞能量CE/eV -13 -20 碰撞室出口電壓CXP/eV -2.0 -2.0 注：對于不同質(zhì)譜儀器，儀器參數(shù)可能存在差異，測定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。 a離子為定量離子。b離子為定性離子。 B B 附　錄　B （資料性附錄） 展青霉素標準品的總離子流圖和二級質(zhì)譜圖 . 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 Time, min 0.0 2000.0 4000.0 6000.0 8000.0 1.0e4 1.4e4 1.6e4 1.8e4 Intensity, cps 3.18 1.2e4 圖B.1　 展青霉素標準品的總離子流圖 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 m/z, Da 0.0 5.0e6 1.0e7 1.5e7 2.0e7 2.5e7 3.0e7 3.5e7 4.0e7 4.5e7 5.0e7 Intensity, cps 81.0 108.9 153.0 82.9 78.9 53.0 135.0 69.0 107.0 124.9 65.0 55.0 圖B.2　 展青霉素標準品的二級質(zhì)譜圖（母離子：m/z 152.9） _________________________________