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分子生物學研究方法和技術(shù),,本人基本情況,1984年獲湖南農(nóng)學院農(nóng)學學士學位。1987年獲中國科學院遺傳研究所理學碩士學位，專業(yè):分子遺傳。 1999年11月-200２年11月 受國家科技部派遣，在日本農(nóng)林水產(chǎn)省北海道國家農(nóng)業(yè)研究中心博士后特別研究員；主要從事基因定位和功能基因的篩選。 １９８４－１９９９年：主要從事水稻細胞質(zhì)雄性不育機理研究；水稻分子育種技術(shù)研究。 １９９９－２０１4：主要從事雜交水稻種子純度快速鑒定技術(shù)研究；水稻品種ＤＮＡ指紋研究；基因定位和分子育種技術(shù)研究。,,1、分子生物學的發(fā)展歷程 1871年，首次發(fā)現(xiàn)DNA（鮭精DNA）。1943年，證明DNA為遺傳分子，而不是蛋白（1944，O T Avery） 1953年，DNA雙螺旋模型提出（J D Watson（美）和F H C Crick（英），1962年或諾貝爾生理學、醫(yī)學獎）。從而為分子生物學這一學科奠基。1961年，合成mRNA，破譯第一個遺傳密碼（M W Nirenberg（美），1968年獲諾貝爾生理學、醫(yī)學獎）——基礎研究的創(chuàng)新，與推動人類文明的進步。（以上被稱為理論上的三大發(fā)現(xiàn)）,1970年，分離出第一個限制性內(nèi)切酶（W Arber（瑞士），1978年獲諾貝爾醫(yī)學獎） 1970年，Baltimore和Temin發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶 ——長期的基礎研究積累迎來了突飛猛進的高潮。 1973年，Cohen把質(zhì)粒作為基因工程的載體使用 ——基礎研究向應用研究的拓展。 （以上被稱為生物工程技術(shù)的的三大發(fā)明）,3個事例： （1）1976年，重組DNA成功（H Boyer和S N Colen，1981年獲諾貝爾化學獎）——勇敢的科學精神。 （2）1982年，美國一制藥公司在2000升發(fā)酵液中提取出100克精制胰島素。相當于從1600磅動物胰腺中的提取量——效率、成本、質(zhì)量、競爭。 （3）荷蘭最早把分子生物學產(chǎn)品“豬牛痢疾疫苗”投放市場，比以上美國的胰島素早半年——后來居上。,人類對生命現(xiàn)象的認識,20世紀 個體 → 染色體 → 基因 →DNA → SNP 生物與非生物間的界限消失了！ 21世紀 基因克隆，拼結(jié) → 組裝植物、動物、嬰兒！,數(shù)、理、化相關學科,生物學實驗技術(shù),滲透 交叉,,近代生物學,,個性,共性,宏觀生物學 （生態(tài)學為核心）,微觀生物學 （分子生物學為核心）,,,細胞水平,分子水平,結(jié)構(gòu)生物學，發(fā)育生物學，神經(jīng)生物學等新興學科發(fā)展,,生物多樣性 研究,資源保護與 利用,人類生態(tài)環(huán)境的保護 工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)持續(xù)發(fā)展,,現(xiàn)代生物學的發(fā)展,,分子生物學,,,,分子生物學的延伸,2 分 子 生物 學 的 概 念,2.1 分子生物學的定義 2.2 分子生物學的三大原則 2.3 分子生物學研究的三大主要領域 2.4 分子生物學發(fā)展的三大支撐學科,2.1 分子生物學的定義,Molecular biology is the study of genes and their activities at the molecular level, including transcription, translation, DNA replication, recombination and translocation. 分子生物學是研究核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征及其重要性、規(guī)律性和相互關系的科學，是人類從分子水平上真正揭示生物世界的奧秘，由被動地適應自然界轉(zhuǎn)向主動地改造和重組自然界的基礎學科。,分子生物學與生物化學之間的關系與區(qū)別,分子生物學—研究生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能及信息傳遞過程，從分子水平研究生命現(xiàn)象。,生物化學—生物體內(nèi)的化學運動，包括化學組成、變化、結(jié)構(gòu)與功能，生物分子間的物質(zhì)與能量轉(zhuǎn)換過程。,分子生物學≠生物化學,★ 構(gòu)成生物大分子的單體是相同的,★ 生物遺傳信息的表達的中心法則相同,高級結(jié)構(gòu),生物大分子之間的互作,,,,2.2 分子生物學的三大原則,共同的核酸語言 共同的蛋白質(zhì),★ 生物大分子單體的排列（核苷酸，氨基酸）,,,,結(jié) 構(gòu) 生 物 學,,基因分子生物學,,生物技術(shù)理論 論與應用,2.3 分子生物學研究的三大主要領域,狹義的分子生物學——分子遺傳學,2.4 分子生物學發(fā)展的三大支撐學科,1839-1847年 Matthias Schleiden & Theodor Schwann,細胞的化學組成，細胞器的結(jié)構(gòu)，細胞骨架，生物大分子在細胞中的定位及功能,分子生物學發(fā)展的三大支撐學科之一,,,,Gregor Mendel 1864 年,Genetics,Molecular Genetics,,,,Gene structure Gene duplication Gene expression Gene recombination Gene mutation,分子生物學發(fā)展的三大支撐學科之二,遺傳因子假說,Genetics,Biochemistry,,,Nucleic Acid Chemistry,Protein Chemistry,Enzymatic nature of crystalline （晶體） Protein,,Biochemistry,3 21 世 紀 分 子 生 物 學 展 望,3.1 自然科學歷史舞臺角色的重大變化 3.2 未來生物學形成的新熱點及領域 3.3 應用生物學發(fā)展 3.4 21世紀— 生命科學的世紀,引導自然科學向物質(zhì)運動最高層次突破的帶頭學科,3.2 未來生物學形成的新熱點及領域,生物大分子的高級三維結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一,生物大分子之間的互作,個體,細胞,分子,,,,,整體論,細胞中的定位,細胞分化,神經(jīng)基質(zhì) 神經(jīng)通道 信息傳遞,計算機語言,分辨，提取，分析， 比較， 預測生物信息,生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能信息,基因的識別與鑒定,基因功能信息的提取與證實,基因表達譜的繪制 (microarray),,蛋白質(zhì)水平上基因互作的探測,,3.3 應用生物學發(fā)展,生物技術(shù),診斷試劑 治療藥物 植物品種 環(huán)境工程 食品加工 生物塑料 廢物處理 再生能源 ……,3.4 21世紀—— 生命科學的世紀,二十一世紀 生命科學的世紀,,學習分子生物學的意義,第一章 RNA的分離純化,主要內(nèi)容,前言 一、核酸分離、純化原則 （一）保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性 （二）防止核酸的生物降解 二、分離提取核酸的主要步驟 （一）細胞的破碎 （二）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除 （三）核酸的沉淀 (四）核酸的濃度測定 （五）核酸的保存,核酸（nucleic acid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達的物質(zhì)基礎。 無論是進行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對核酸進行分離和純化。 核酸樣品質(zhì)量將直接關系到實驗的成敗。,前 言,一、核酸分離、純化原則,（一）保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性 1 意義 遺傳信息全部儲存在一級結(jié)構(gòu)之中，核酸的—級結(jié)構(gòu)還決定其高級結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。 2 分離核酸原則： 1）溫度不要過高； 2）控制一定的pH值范圍(pH值5-9); 3）保持一定的離子強度; 4）減少物理因素對核酸降解的機械剪切力.,（二）防止核酸的生物降解,細胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結(jié)構(gòu)。 所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。,1. DNA酶抑制劑,1） 金屬離子螯合劑： DNA酶需要金屬二價離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉)、8-羥基喹啉； 2） 陰離于型表面活性劑： 如SDS，該試劑除對核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負電荷的復合物，該復合物在高鹽溶液中沉淀。,2. RNA酶（RNAase)抑制劑,RNAase分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不宜失活。 (1) 皂土（bentonite ） 作用機制：皂土帶負電荷，能吸附RNase，使其失活。,(2) DEPC(二乙基焦碳酸鹽) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液體，很強的核酸酶抑制劑。 作用機制：與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性。 使用注意： 1）DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大100～1000倍。 2）容易降解，保存在4 ℃或液氮中； 3）提RNA時，0.1% DEPC浸泡器皿37℃ 2 h。 4）劇毒。,（3) 肝素 （4）復合硅酸鹽（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧釩核糖核苷復合物 (Vanadyl-Ribonucleoside Complex, VRC),二 分離提取核酸的主要步驟,（一）細胞的破碎 1 高速組織搗碎機搗碎 2 玻璃勻漿器勻漿 3 超聲波處理法 4 液氮研磨法 5 化學處理法(SDS、吐溫80等） 6 生化法（溶菌酶、纖維素酶等）,（二）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除 核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結(jié)合)、氫鍵和非極性的范德華力。 分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開，同時避免核酸降解。,常用方法： 1. 加入濃鹽溶液（如NaCl） 核酸-蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚； 2. 加入SDS SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來的功能；,3 . 酚/氯仿抽提 酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對核酸酶有抑制作用。 氯仿比重大，能加速有機相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。 在酚/氯仿抽提核酸提取液時，需要振搖，為防止起泡和促使水相與有機相的分離，再加上一定量的異戊醇（酚：氯仿：異戊醇=25：24：1）。,1）使用注意 酚通常是透明無色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實驗，因為氧化物可破壞核酸的磷酸二酯鍵。 2）安全操作 酚腐蝕性很強，并可引起嚴重的灼傷，操作時應戴手套。,使用酚時應注意,（三）核酸的沉淀,沉淀是濃縮核酸最常用的方法。 優(yōu)點： ①改變核酸的溶解緩沖液； ②重新調(diào)整核酸的濃度； ③去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。,1. 核酸沉淀的鹽類及濃度,2. 有機沉淀劑,（1）乙醇 優(yōu)點： 對鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實驗。 缺點： 需要量大，一般要求低溫操作。,（2）異丙醇,優(yōu)點： 需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長時間放置。 缺點： 易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀．異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最后用70％乙醇漂洗數(shù)次。,（3）聚乙二醇（PEG）,優(yōu)點： 可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同相對分子質(zhì)量的DNA片段。應用6000相對分子質(zhì)量的PEG進行DNA沉淀時，使用濃度與DNA片段的大小成反比。 注意： PEG沉淀一般需要加入0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。,（4）精胺,精胺不是有機溶劑，但可快速有效沉淀DNA。 原理是： 精胺與DNA結(jié)合后，使DNA在溶液中結(jié)構(gòu)凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)與DNA分開，達到純化DNA的目的。,3. 核酸沉淀的溫度和時間,一般強調(diào)，核酸沉淀在低溫長時間下進行。低溫長時間沉淀，易導致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實驗。一般使用0℃冰水，10-15min， DNA樣品足可達到實驗要求。,(四）核酸的濃度測定,1. 紫外分光光度法測定DNA和RNA的含量 前提：核酸樣品要較純，無顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測定濃度應大于0.25 μg/ml 。 結(jié)論：在波長260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相當于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA為37 μg/ml；RNA為40 ug/ml。,紫外分光光度計測定核酸濃度的操作步驟,a．吸取一定量的DNA樣品或RNA樣品，加水至特定體積后，轉(zhuǎn)入分光光度計的石英比色杯中。 b．分光光度計先用一定量的水校正零點。 c．測定待測樣品在230nm、260nm和280nm的OD值。 d．計算濃度。 雙鏈DNA樣品濃度(μg/μl) = OD260×核酸稀釋倍數(shù)× 50； RNA樣品濃度(μg/μl) = OD260×核酸稀釋倍數(shù)×40。 e．分析純度。,A：測DNA： 純的DNA樣品OD260/OD280應為1.8，OD260m／OD230應大于2.0。 1) OD260/OD280大于1.9時，表明有RNA污染。 2) 小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染； 3) OD260/OD230小于2.0時，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、酚等。 注： 可能出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況。,測定結(jié)果分析,B：測RNA 純的RNA樣品其OD260／OD280應介于1.7-2.0之間，OD260/OD230比值應大于2.0。 1）若RNA樣品OD260/OD280比值太小，說明有蛋白質(zhì)或酚的污染； 2）比值大于2.0時，可能被異硫氰酸胍等污染； 3）OD260/OD230比值小于2.0時表明有小分子及鹽存在。,2. 溴乙錠熒光法測定核酸的含量,如果DNA和RNA的量很少或有較多雜質(zhì)的情況下，其含量可用溴乙錠熒光法測定。 原理：DNA、RNA本身并不產(chǎn)生熒光，但在熒光染料溴乙錠(EB)嵌入堿基平面之間后，DNA樣品在紫外光激發(fā)下，可發(fā)出紅色熒光，熒光強度與核酸含量成正比。使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標準對照，可比較出被測DNA溶液濃度。 注意：此法的比較主要基于目測，是估計水平。,（五）核酸的保存,對DNA保存： ① DNA樣品溶于pH8.0的TE，4 ℃或-20 ℃保存； ② 長期保存樣品中可加入1滴氯仿。 對RNA 保存： ①RNA樣品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70 ℃保存; ② 長期保存可以沉淀形式貯于乙醇中; ③在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧釩核糖核苷復合物)凍貯于-70℃,可保存數(shù)年。,總RNA提取,目 的 1．了解某一特定組織或細胞某一特定mRNA轉(zhuǎn)錄量的變化，如PCR、Northern blot等。 2．了解某一特定組織或細胞全部mRNA轉(zhuǎn)錄量的變化，如DD-PCR、基因芯片等。 3．獲得某一特定組織或細胞全部mRNA，以便建立cDNA庫等。 4．獲得某一特定組織或細胞全部RNA。 以上工作的前提是制備純凈且完整的RNA。,根據(jù)生物學“中心法則”原理，基因的表達包括轉(zhuǎn)錄與翻譯兩個階段。其中，由DNA到RNA的轉(zhuǎn)錄過程受到各種因素的調(diào)節(jié)，其調(diào)節(jié)水平反映出某種或某些特定的因素對相關基因表達的調(diào)節(jié)能力。 RNA主要由rRNA（占總量的80-85％），tRNA和核內(nèi)小分子RNA（占總量的10-15％）以及mRNA（占總量的1-5％）所構(gòu)成。理論上認為每克組織（或108個培養(yǎng)細胞）可提取5-10mg RNA。,提取總RNA的方法有多種，比如： 1) 酚/SDS法 2）采用Trizol試劑盒或類似的方法，稱為一步法，方便而快捷。缺點是RNA的獲得量偏低，質(zhì)量不夠純凈。 3）超離心方法，可以獲得豐富且質(zhì)量高的RNA。缺點是實驗時間比較長，要求離心過夜。 4）其它一些試劑盒，主要是利用某些特定的介質(zhì)吸附RNA，洗去其它雜質(zhì)，最后洗脫純凈的RNA?？梢栽诙虝r間內(nèi)獲得純凈的RNA。但是價格比較昂貴。,植物總RNA提取(酚/SDS法 ),材料,液氮 研磨緩沖液：0.18mol/L?Tris 0.09mol/L LiCL 4.5mmol/L EDTA 1%（W/V）SDS 用HCL調(diào)PH至8.2,1mol/L Tris的配法：,在800 雙蒸水中溶解121克Tris堿，用濃鹽酸調(diào)PH值，混勻后加水至1升。,要獲得所需PH值的1M ?Tris HCL，可通過將一定數(shù)量的10M HCL和1升Tris堿混合，如下表所示:,0.5M EDTA的配制：,在700ML雙蒸水中溶解186.1克Na2EDTA.2H2O，用NaOH調(diào)PH8.0（1000ML 0．5M EDTA需加入20克NaOH），補加雙蒸水至1升。,TLE緩沖液平衡酚 TLE溶液: 0.2mol/L?Tris 0.1mol/L LiCL 5mmol/L EDTA 用HCL調(diào)PH至8.2，用等體積的PH8.0的TLE溶液抽提，然后再用TLE溶液至少抽提2次,氯仿：異戍醇（24：1） 8MOL/L和2MOL/L LICL溶液（DEPC處理，焦碳酸二乙酯） 3MOL/L乙酸鈉（DEPC處理），將408克NaAc.3H2O溶于水，用3MOL/L乙酸調(diào)PH5.2，補加水至1升95%乙醇DEPC處理水,試驗步驟：,1、 用液氮冷卻研缽，取15g低溫冷凍的植物組織，迅速置于研缽中，不時加入液氮以防止研磨過程中葉片融化，充分研磨后，立即轉(zhuǎn)移到一個盛有150ML研磨緩沖液和50ml TLE緩沖液平衡酚的500ml離心管中。 2、 加入50ml氯仿：異戍醇，于50℃加熱20 min 。18000g, 4℃，離心20 min。,3、將上層水相轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，加入50ml TLE緩沖液平衡酚的500ml，混勻，再加入50ml氯仿：異戍醇，18000g, 4℃，離心20 min。,4、用 TLE緩沖液平衡酚抽提水相，直至兩面相間界面干凈為止，水相再以氯仿抽提。 5、 吸取上清液，加1/3體積的8M/L LiCL混合至終濃度為2M/L，4℃沉淀過夜，然后15000g，4℃， 離心20 min，沉淀以2-3ml 2M/L LiCL溶液沖洗。 6、沉淀以5ml水重溶，加入1/3體積的8M/L LiCL混合至終濃度為2M/L，于 4℃深沉RNA兩小時以上。,7、 15000g，4℃， 離心20 min，沉淀用2ml 2M/L LiCL溶液沖洗，重溶于2ml雙蒸水，加入200ul 3MOL/L乙酸鈉溶液和5.5ml無水乙醇，-20℃沉淀過夜或在干冰/乙醇中沉淀30 min。 8、18000g, 4℃，離心15min，沉淀用1ml雙蒸水溶解，取10 ul稀釋至1ml測OD260和OD280,Trizol試劑盒方法,原 理 本實驗類似于“異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法”。方法采用強RNA酶抑制劑異硫氰酸胍，抑制RNA酶的活性，防止RNA的降解；酚/氯仿使蛋白質(zhì)變性。離心后，RNA選擇性地進入無DNA和蛋白質(zhì)的水相。之后通過異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌等，便可得到較為完整與純潔的總RNA。,實驗步驟 1．取50毫克植物細嫩組織，加入1ml Trizol液，剪碎，快速勻漿。 2．22℃，靜置5min。 3．加入氯仿0.2ml，顛倒15s。 4．22℃，靜置3min。 5．離心：4℃×15000轉(zhuǎn)/分×15min。 6．取上清液0.45ml。 7．加入0.45ml異丙醇，混勻。,8．22℃，靜置10min。 9．離心：4℃×15000轉(zhuǎn)/分×10min。 10．棄上液。 11．加入1ml 4℃ 75%乙醇。 12．離心：4℃×10000轉(zhuǎn)/分×5min。 13．棄上液，真空干燥5min。 14．用高壓消毒過的去離子水25ul水冰上溶解，-70℃保存。 15．紫外分光光度計測定RNA的含量：,取樣本5ul加入石英比色杯內(nèi)，加入蒸水1ml，充分混勻。與蒸鎦水對照。讀260nm、280nm兩個測得值，記錄。計算： OD260為1時，為40ug RNA，所以計算如下： 樣本RNA含量（ug/ul）= OD260*200*40/1000 當OD值260/280<1.8時，提示有蛋白或酚的污染。,實驗結(jié)果 得到比較純凈的植物組織總RNA。 分光光度計讀數(shù) 260/280 值為 1.85±0.04。,植物RNA提取中的一些特殊方法,1、多酚類植物的RNA提取： ? ?蘋果、棉花等多酚類植物提取RNA用TRIZOL一般提不出來。用下述方法提取的RNA純度不是特別高,但是用作northern足夠。 （1）1.5ml離心管用液N2冷凍后加入0.1g樣品,立即加入500ul酚氯仿,再加入500ul提取buffer,劇烈振蕩1-2min,冰上放置5min.（2）4 ℃ 12000rpm離心15min, 上清轉(zhuǎn)入新管,加氯仿異戊醇抽提一次（3）取600ul異丙醇,-20 ℃沉淀20min.（4）12000rpm離心10min（5）沉淀用70%乙醇洗（6）8000rpm 5min（7）沉淀晾干,溶于30ulDEPC水,2、 纖維組織： 　　心臟/骨骼肌等纖維組織提取RNA的關鍵在于徹底破碎組織。這些組織細胞密度低，單位重量的組織RNA的含量就少，建議用盡可能多的起始量。使用TRNzol法可以提取纖維組織終RNA，由于纖維組織終RNA含量較少，可按照增加的起始量成比例增加TRNzol的用量，并在液氮中將組織徹底磨碎，同時適當減少溶解RNA的溶液體積。,3、 蛋白/脂肪含量高的組織：動物的腦和某些特殊的植物組織中，脂肪或者蛋白的含量很高，可以采用TRNzol來提取此類樣品中的RNA。在該提取過程中，用氯仿抽提后，如上清仍含白色絮狀物，必須用氯仿再次對上清進行抽提。使用TRNzol提取脂肪含量高的組織中RNA時，使用氯仿抽提后會分成油滴、水相（含RNA）、DNA中間層、有機相四層，應用移液管小心吸取水相液體，避免吸到油滴層和DNA層。,4、 核酸/RNase含量高的組織：　　脾、胸腺、胰臟等組織的核酸和核酸酶含量很高，可以在液氮中碾磨組織，再快速勻漿。如果裂解液太粘稠（因為核酸含量高的緣故），酚/氯仿抽提不能有效分層，可以加入更多裂解液以解決此類問題。如果加入乙醇后馬上有白色沉淀形成則表明有DNA污染，可以在核酸溶解后用酸性酚/氯仿再次抽提，去除DNA污染。,5、 植物組織和真菌組織： 　　植物組織和真菌組織比動物組織更為復雜，因此為了避免出現(xiàn)內(nèi)源酶作用使 RNA降解的現(xiàn)象，一般選擇在液氮條件下對植物或者真菌材料進行碾磨。如果降解問題不能解決，基本上是由于樣品中的內(nèi)含雜質(zhì)導致。許多植物和真菌中的內(nèi)含雜質(zhì)如多糖、多酚等都會殘留，因為這些雜質(zhì)分子與RNA有一些相似性，可以與RNA同時沉淀或者吸附，因此在植物和真菌組織的RNA提取過程中，需要用一些特別的步驟或者特別的試劑（RNAplant）來去除多糖多酚等雜質(zhì)的干擾和污染。,病毒RNA提取方法,異硫氰酸胍提取法:實驗步驟：1、 取200ul樣品數(shù)+陰性對照+陽性對照個1.5ml滅菌eppendorf管。2、 加600ul異硫氰酸胍，然后加入對照和樣品，再加200ul氯仿，顛倒混勻。3、 13000rpm離心15min。4、 在第3步離心快結(jié)束時，另取同樣多eppendorf管，加入400ul -20度預冷的異丙醇。,5、 取第3步離心的上清（一定不要吸取到中間白色層，第3步離心結(jié)束往外拿的時候，管子盡量不要傾斜）轉(zhuǎn)移到第4步準備的管中，顛倒混勻。6、 13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體。?7、 加600ul 75％乙醇，顛倒數(shù)次以洗滌殘存異丙醇。,8、 13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體。 9、 4000rpm離心10s，將管壁殘存液體甩到底部，用微量槍頭吸干，室溫干燥2－3min（不可過分干燥，防止下一步RNA不溶解）。 10、 加入20ul DEPE水(加入depc的純水高壓后的水即為DEPE水)，輕輕混勻溶解RNA。2000rpm離心5s，冰上保存?zhèn)溆茫ㄗ詈?小時內(nèi)使用，以免RNA降解）。,RNA提取注意事項,一些RNA提取方法，在進行具體實驗時，應根據(jù)研究對象的性質(zhì)，提取核酸的用途而對上述方法在操作步驟和試劑使用量上作一定的修改。1、 在核酸提取時，為了增加細胞的裂解度，增加核蛋白復合體破碎度，以釋放更多的游離核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在確保沒有核酸水解酶存在的前提下，酶反應時間越長越好。,2、 有時在使用蛋白酶時，為了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶緩沖液中用終濃度5mM的EDTA代替NaCL，并且可將反應溫度提高到50－60℃，并將反應時間縮短到15－25min，但酶用量必須提高10－20倍。溶菌酶使用時緩沖液中需加EDTA，因游離金屬離子對酶有抑制。,3、 許多植物材料中富含酚，在細胞破碎時，在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的醌類物資，影響核酸的提取及降低提取質(zhì)量，在提取液中加入PVP和巰基乙醇對降低酚類的干撓可能有所幫助。PVP將與酚形成復雜的聚合體，在提取時將酚從核酸成分中游離。且PVP與巰基乙醇作為強還原劑可防止多酚的褐變。另外作為還原劑的這些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。,4、 許多生物材料在提取核酸時，都會遇到多糖的污染問題，具體表現(xiàn)為有機溶劑沉淀時，沉淀很多，但復溶時，大量沉淀不溶，電泳觀察時核酸含量很低。,5、 在核酸提取時，酚與氯仿均起到變性的作用。酚的變性能力強于氯仿，但酚與水有一定的互溶，因此酚抽后，除可能損失部分核酸外，水相中還會殘留酚，而酚的存在將對核酸的酶反應產(chǎn)生強的抑制，因此在操作中可單用氯仿作變性劑、也可用酚/氯仿混合變性，也可用單一酚作變性己，但用單一酚后在有機溶劑沉淀時一定要用氯仿從抽提。6、 在操作中當加入變性劑氯仿后，為了保證核酸樣品的完整性，操作要輕，尤其在提DNA時，更要避免劇烈操作。,7、 在沉淀核酸時可用乙醇與異丙醇，乙醇的極性要強于異丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高時，用異丙醇沉淀可部分克服這種污染，尤其用異丙醇在室溫下沉淀對擺脫多糖、雜蛋白污染更為有效。 8、 在提取核酸時，如樣品濃度低，則應增加有機溶劑沉淀時間，－70℃下>30min;－20℃過夜將有助于增加核酸的沉淀量。,9、 在核酸提取過程中有機溶劑沉淀后復溶時可加水因此時離子濃度可能較高，而到高度純化后低溫保存時最好復溶于TE緩沖液中，因溶于TE的核酸儲藏穩(wěn)定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸樣品保存時要求以高濃度保存，低濃度的核酸樣品要比高濃度的更易降解。,10、 核酸提取后可通過PCR 、RT－PCR直接擴增出目的基因片斷，也可首先構(gòu)建文庫、然后由dd-PCR等差異顯示技術(shù)、AFLP等標記技術(shù)、差異雜交或文庫扣除技術(shù)等方法篩選出特異探針，再用此探針從文庫中篩選出完整基因。,11、 在抽提過程中，若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多，可以增加抽提次數(shù).提取RNA請盡量在低溫下操作，如果條件不容許，在室溫下操作的時間要盡可能的短。,克服多糖污染可采用以下一些辦法1) CTAB多次抽提。 2) 在有機溶劑沉淀時先稀釋樣品濃度（可到10倍左右），對低濃度樣品再進行沉淀。 3) 在有機溶劑沉淀時選用異丙醇和5MNaCL作為沉淀溶劑，此時氯化鈉的用量可用到1/5-1/2的體積，異丙醇可用到0.6-1的體積。異丙醇沉淀核酸時，高濃度鹽存在將使大量多糖存在在溶液中，從而可達到去多糖的作用。但高濃度的鹽存在會影響核酸的進一步操作，因此必須用乙醇多次洗滌脫鹽。,針對RNA酶的一些注意事項,防止RNA酶污染的措施： 1、 所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。2、 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。 3、 有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。,4、 配制的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。 5、??操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。 6、 設置RNA操作專用實驗室，所有器械等應為專用。,7、 DEPC能與胺和巰基反應,因而 含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理8、 加樣原則是DNA最后加，其他試劑按照體積大小從大往小的加。如果是同種引物和探針有多管的話只是DNA不同，那么采取的方法是算出總體積后加在一個管子里面，混合均勻之后再分裝到各個管子里去，這樣可以有效地避免誤差及污染。 9、 普通實驗室容易污染，且污染程度很高，與跑電泳還有質(zhì)粒制備提取都在同一個房間里有比較大的關系，最容易造成高濃度污染的就是產(chǎn)物的開蓋和質(zhì)粒的稀釋。因此要格外注意一些。,謝謝！,Thank you,