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ICS67.120.30 B 50 T/ZACA 團體標準 T/ZACA XXXXX—XXXX 豆芽中氟喹諾酮和硝基咪唑類藥物殘留量測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法 Determinationof residues of fluoroquinolones and nitroimidazoles in beansprout-Liquid chromatography-tandem mass spectrometry XXXX - XX - XX發(fā)布 XXXX - XX - XX實施 浙江省質(zhì)量合格評定協(xié)會發(fā)布 T/ZACA XXXXX—XXXX 目次 前言 II 1　范圍 1 2　規(guī)范性引用文件 1 3　原理 1 4　試劑和材料 1 5　儀器 2 6　試樣的制備與保存 2 7　分析步驟 2 8　精密度、靈敏度和準確度 5 附錄A（資料性附錄）　氟喹諾酮類及硝基咪唑類藥物中英文名稱、CAS號、分子式和相對分子質(zhì)量 6 附錄B（資料性附錄）　氟喹諾酮類及硝基咪唑類藥物混合標準溶液選擇離子流圖(20　μg/kg) 7 前言 本標準依據(jù)GB/T 1.1-2009給出的規(guī)則起草。 請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別這些專利的責任。 本標準由浙江省質(zhì)量合格評定協(xié)會提出。 本標準由浙江省質(zhì)量合格評定協(xié)會歸口。 本標準主要起草單位：綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司、浙江省疾病預防控制中心。 本標準參與起草單位：浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所、湖州市農(nóng)畜水產(chǎn)品檢測中心、麗水藍城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司。 本標準主要起草人：余鵬飛、何曉明、章舒祺/徐小民、楊魯瓊、洪琳、倪娟楨、田佩琪、徐杰、沈東強、朱萌萌、周婷婷、盧軍、陳志民、朱麗婷。 本標準為首次發(fā)布。 9 豆芽中氟喹諾酮和硝基咪唑類藥物的測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法 1　 范圍 本標準規(guī)定了豆芽中恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、達氟沙星、洛美沙星、甲硝唑、二甲硝咪唑、異丙硝唑、洛硝噠唑含量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。 本標準適用于豆芽中恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、達氟沙星、洛美沙星、甲硝唑、二甲硝咪唑、異丙硝唑、洛硝噠唑含量的測定。 2　 規(guī)范性引用文件 下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。 3　 原理 試樣用1%乙酸乙腈提取，經(jīng)均質(zhì)提取、濃縮、正己烷凈化、離心后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，用基質(zhì)外標法定量。 4　 試劑和材料 除特殊注明外，所有試劑均為分析純，水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。 4.1　 試劑 4.1.1　 乙腈：色譜純。 4.1.2　 乙腈：分析純。 4.1.3　 乙酸：分析純。 4.1.4　 氯化鈉：分析純。 4.1.5　 甲醇：色譜純。 4.1.6　 甲酸：色譜純。 4.1.7　 甲酸銨：色譜純。 4.1.8　 正己烷：色譜純 4.2　 試劑配制 4.2.1　 1%乙酸乙腈：移取5 mL乙酸（4.1.3）和495 mL乙腈（4.1.2）混合。 4.2.2　 復溶液（0.1%甲酸30%甲醇水溶液）：300 mL甲醇（4.1.5）、1mL甲酸和699mL水混合。 4.3　 標準品 氟喹諾酮類8種、4種硝基咪唑類標準物質(zhì)：純度均大于等于90%（詳見附錄A） 4.4　 標準溶液配制 4.4.1　 標準儲備溶液 標準儲備液：準確稱取適量每種氟喹諾酮和硝基咪唑類標準物質(zhì)（4.3）于25.00mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混合均勻，轉(zhuǎn)移至儲液瓶中，-18℃以下避光保存，有效期為6個月。 4.4.2　 標準中間液 標準中間液：分別準確移取每種標準儲備液（4.4.1）于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成10.0mg/mL的標準中間液，混合均勻，轉(zhuǎn)移至儲液瓶中，-18℃以下避光保存，有效期為3個月。 4.4.3　 混合標準工作液 分別準確移取每種1.00 mL標準中間液（4.4.2）于10.00mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成1.00mg/mL混合均勻，轉(zhuǎn)移至儲液瓶中，4℃以下避光保存，有效期為7天。 4.4.4　 標準工作曲線 移取一定體積的混合標準工作液（4.4.3）用空白基質(zhì)液分別配制成含4.00μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100μg/L、250μg/L、500 μg/L的8種氟喹諾酮類和4種硝基咪唑類標準工作溶液，濃度由低到高進樣檢測，以定量子離子的峰面積為縱坐標，對應濃度為橫坐標，采用直線擬合的方式繪制標準工作曲線。實際檢測中，經(jīng)驗證后可適當調(diào)整標準曲線的濃度范圍。 5　 儀器 5.1　 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧（ESI）離子源。 5.2　 高速組織搗碎機。 5.3　 分析天平，感量0.01g和0.00001g. 5.4　 氮吹儀。 5.5　 渦旋混勻器（2500 r/min）。 5.6　 離心機：轉(zhuǎn)速≥12000 r/min。 5.7　 超聲清洗儀。 5.8　 10mL試管。 5.9　 離心管：50 mL。 5.10　 容量瓶：25 mL。 5.11　 尼龍膜:0.22 μm。 6　 試樣的制備與保存 取代表性豆芽樣品約500 g，將其切碎后（不可用水洗），經(jīng)高速組織搗碎機均勻搗碎，均分成兩份，裝入潔凈容器內(nèi)，密封，-18℃以下保存。 7　 分析步驟 7.1　 樣品處理 稱取5 g（精確至0.01g）試樣，于50 mL離心管中，加入5mL水和10mL1%乙酸乙腈（4.2.1）均質(zhì)1 min，超聲提取20min，加入5g氯化鈉（4.1.4）渦旋1min，12000 r/min離心3min，上層有機相轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中。殘渣再用10 mL1%乙酸乙腈（4.2.1）重復提取一次，合并兩次提取液，用1%乙酸乙腈（4.2.1）定容到25mL，混合均勻，準確移取10mL提取液于10mL試管中，40℃氮吹至近干。加入1mL復溶液（4.2.2），超聲3min、渦旋3min，溶解殘渣，再加入1 mL正己烷，渦旋30s，12000 r/min離心3min，取下層清液過0.22 μm尼龍膜于樣品瓶中，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。 7.2　 測定 7.2.1　 液相色譜條件 7.2.1.1　 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3，2.1100mm（i.d.），1.8 m，或性能相當者。 7.2.1.2　 進樣量：5μL。 7.2.1.3　 流速為：0.35mL/min。 7.2.1.4　 柱溫：35℃ 7.2.1.5　 流動相：A為0.1%甲酸2 mmol甲酸銨水溶液；B為0.1%甲酸乙腈。梯度洗脫條件見表1。 表1　 梯度洗脫程序 時間/min 流速/（mL/min） 流動相A/（%） 流動相B/（%） 0.00 0.35 93 7 0.50 0.35 93 7 3.00 0.35 75 25 4.50 0.35 5 95 5.00 0.35 5 95 5.01 0.35 93 7 7.00 0.35 93 7 7.3　 質(zhì)譜條件 7.3.1　 離子源為電噴霧離子源（ESI）。 7.3.2　 掃描方式為正離子掃描。 7.3.3　 檢測方式為多反應監(jiān)測。 7.3.4　 干燥氣流量：8.0L/min。 7.3.5　 加熱氣流量：10L/min。 7.3.6　 接口溫度：300℃。 7.3.7　 霧化氣流量：2.8L/min。 7.3.8　 DL管溫度：250℃。 7.3.9　 加熱塊溫度：400℃。 7.3.10　 毛細管電壓：4000V。 7.3.11　 定性離子對、定量離子對、碰撞能量（CE）和偏轉(zhuǎn)電壓（Q1、Q3）見表2。 表2　 多反應監(jiān)測條件 被測物名稱 參考保留時間/min 母離子（m/z） 子離子（m/z） Q1電壓/V CE Q3電壓/V 恩諾沙星 4.36 360.20 316.20* -13.0 -19.0 -15.0 342.20 -13.0 -21.0 -16.0 諾氟沙星 4.02 320.20 302.15* -12.0 -20.0 -22.0 231.05 -12.0 -38.0 -25.0 培氟沙星 4.08 334.20 316.15* -26.0 -21.0 -22.0 290.15 -26.0 -18.0 -14.0 環(huán)丙沙星 4.10 332.20 314.15* -23.0 -20.0 -23.0 231.10 -23.0 -37.0 -25.0 氧氟沙星 4.05 362.20 318.20* -14.0 -19.0 -21.0 261.15 -14.0 -27.0 -13.0 沙拉沙星 4.48 386.20 368.05* -14.0 -23.0 -26.0 342.10 -14.0 -19.0 -24.0 洛美沙星 4.26 352.20 265.10* -27.0 -23.0 -12.0 308.20 -27.0 -16.0 -21.0 達氟沙星 4.26 358.20 340.15* -30.0 -30.0 -30.0 82.10 -30.0 -50.0 -29.0 甲硝唑 2.94 172.10 128.10* -22.0 -13.0 -24.0 82.15 -22.0 -25.0 -29.0 二甲硝咪唑 3.46 142.10 96.15* -10.0 -17.0 -18.0 81.15 -10.0 -25.0 -30.0 洛硝噠唑 3.31 201.10 140.10* -14.0 -14.0 -14.0 55.20 -14.0 -23.0 -24.0 異丙硝唑 4.80 170.10 109.15* -21.0 -25.0 -22.0 124.20 -21.0 -21.0 -23.0 注： 帶“*”的離子為定量離子；對于不同質(zhì)譜儀，儀器參數(shù)可能存在差異，測定前應將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。 7.4　 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定 7.4.1　 定量測定 采用基質(zhì)加標單點法或者基質(zhì)標準工作曲線法定量。根據(jù)試樣中被測組分的含量，選取響應值適宜的標準工作液進行分析。標準工作溶液和待測樣液中8種氟喹諾酮和4種硝基咪唑的響應均在方法的線性響應范圍內(nèi)。如果含量超過標準曲線范圍，可調(diào)整取樣量、定容體積，重新處理樣品后進行測定。在上述色譜條件下，參考保留時間參見表2；標準溶液多反應監(jiān)測色譜圖見附錄B中B.1。 7.4.2　 定性測定 在相同的實驗條件下，樣液中被測物的色譜峰保留時間與標準溶液色譜峰的保留時間相比較，變化范圍應在2.5%之內(nèi)；并且在扣除背景后的樣液圖譜中，所選的離子對均出現(xiàn)，各定性離子的相對豐度與標準品離子的相對豐度相比，偏差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在對應的被測物。 表3　 定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差 相對離子豐度/% ≥50 ＞20至50 ＞10至20 ≤10 允許的相對偏差/% 20 25 30 50 7.4.3　 空白試驗 除不加試樣外，均按上述測定步驟進行。 7.4.4　 結(jié)果計算和表述 試樣中被測組分含量按式（1）計算，計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。 X=CV1000m10001025 …………………………………………（1） 式中： X——試樣中被測組分的含量，單位為微克每千克（mg/kg）； c——標準曲線計算出的試樣上機液中被測組分的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）； V——試樣的定容體積，單位為毫升（mL）; m——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）。 8　 精密度、靈敏度和準確度 8.1　 精密度 在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20%。 8.2　 靈敏度 本方法定量限為2.0 μg/kg。 8.3　 準確度 本方法中被測組分的添加濃度在2.00mg/kg~250mg/kg時，回收率為70.0%~120%。 A A 附　錄　A （資料性附錄） 氟喹諾酮類及硝基咪唑類藥物中英文名稱、CAS號、分子式和相對分子質(zhì)量 表A.1　 氟喹諾酮類及硝基咪唑類藥物中英文名稱、CAS號、分子式和相對分子質(zhì)量 序號 中文名稱 英文名稱 CAS號 分子式 相對分子質(zhì)量 1 恩諾沙星 Enrofloxacin 93106-60-6 C19H22FN3O3 359.4 2 諾氟沙星 Norfloxacin 70458-96-7 C16H18FN3O3 319.3 3 培氟沙星二水甲磺酸鹽 Pefloxacin mesylate 70458-95-6 C18H24FN3O6S 429.5 4 環(huán)丙沙星 Ciprofloxacin 85721-33-1 C17H18FN3O3 331.3 5 洛美沙星 Lomefloxacin 98079-51-7 C17H20ClF2N3O3 387.8 6 氧氟沙星 Ofloxacin 82419-36-1 C18H20FN3O4 361.4 7 鹽酸沙拉沙星 Sarafloxacin Hydrochloride 91296-87-6 C20H18ClF2N3O3 421.8 8 甲磺酸達氟沙星 Danofloxacin Mesylate 119478-55-6 C20H24FN3O6S 453.5 9 甲硝唑 metronidazole 443-48-1 C6H9N3O3 171.2 10 二甲硝咪唑 Dimetridazol 551-92-8 C5H7N3O2 141.1 11 異丙硝唑 Ipronidazole 14885-29-1 C7H11N3O2 169.2 12 洛硝噠唑 Ronidazole .7681-76-7 C6H8N4O4 200.1 B B 附　錄　B （資料性附錄） 氟喹諾酮類及硝基咪唑類藥物混合標準溶液選擇離子流圖(20 μg/kg) 表B.1氟喹諾酮類及硝基咪唑類藥物混合標準溶液選擇離子流圖(20 μg/kg) a) 甲硝唑 b）二甲硝咪唑 c)異丙硝唑 d）洛硝噠唑 e）諾氟沙星 f）氧氟沙星 g）培氟沙星 h）環(huán)丙沙星 i）洛美沙星 j）沙拉沙星 k）達氟沙星 l）恩諾沙星 _________________________________