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1、,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣

2、式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10

3、/10,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,細胞培養(yǎng)中污染物的預防與清除,中科院上海生化細胞所,2016，Jan，22-24,2021/10/10,1,培訓班目的：,提高各生物資源保藏庫在資源保藏、評價方面的科技創(chuàng)新與服務能力。,資源保藏、評價,創(chuàng)新能力,服務能力,（科學院對我們的要求）,2021/10/10,2,十八大明確提出要“實施創(chuàng)新驅動發(fā)展戰(zhàn)略，強調科技創(chuàng)新是提高社會生產(chǎn)力和綜合國力的戰(zhàn)略支撐，必須擺在國家發(fā)展全局的核心位置”。,我國科技服務業(yè)已經(jīng)具備一定的發(fā)展基礎，但是與英、美等發(fā)達國家相比，我國的科技服務

4、業(yè)產(chǎn)值及其占,GDP,比重較低，,2011,年度實現(xiàn)科技服務增加值不足,7000,億元，占,GDP,比重約為,1.4%,。,2014,年,10,月，國務院印發(fā),關于加快科技服務業(yè)發(fā)展的若干意見,（國發(fā),201449,號），這是國務院,首次,對,科技服務業(yè),發(fā)展作出的全面部署。,用創(chuàng)新驅動科技服務業(yè)的發(fā)展,（國家對我們的要求）,2021/10/10,3,細胞資源為生物醫(yī)藥基礎研究和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供支撐和保障,細胞資源保藏和技術研發(fā),人類遺傳資源庫,基礎研究實驗細胞庫,國家發(fā)展和安全戰(zhàn)略,2021/10/10,4,一，,細胞系是重要的遺傳資源。細胞庫的功能包括資源,保藏,能力、資源,利用,能力和資源,

5、開發(fā),能力。這三方面的提升是建設一流細胞保藏單位的關鍵抓手，也是推動細胞庫向科技服務業(yè),轉移重心,的必經(jīng)之路。,二，,保證細胞株不受污染是細胞庫保藏能力的關鍵性標志，也是其他能力提升的基礎。,2021/10/10,5,一，,細胞系是重要的遺傳資源。由細胞庫（,Cell Bank,）負責保存細胞系。,細胞庫,技術咨詢,對外供應,鑒定檢測,文檔管理,細胞培養(yǎng),質量控制,保藏、評價,開放、共享,技術服務,培訓科普,2021/10/10,6,一，,細胞系是重要的遺傳資源。負責保存細胞系的細胞庫應當開發(fā)、承擔更多的功能，提升服務科技、服務社會的能力，產(chǎn)生更高的服務業(yè)產(chǎn)值。,細胞庫,技術咨詢,對外供應,鑒

6、定檢測,文檔管理,細胞培養(yǎng),質量控制,保藏、評價,開放、共享,技術服務,培訓科普,拓寬收集渠道,提升保藏特色,瞄準科技發(fā)展前沿提升利用開發(fā)水平,2021/10/10,7,一，,細胞系是重要的遺傳資源。保存細胞系的細胞庫其功能包括資源保藏能力、資源利用能力和資源開發(fā)能力。這三方面的提升是建設一流細胞保藏單位的關鍵抓手。,中科院細胞庫,堅持國際接軌的細胞保藏技術水平，積極吸引國內有知識產(chǎn)權的細胞系進入細胞庫保藏，逐步形成自己的特色。,堅持用戶至上的服務態(tài)度，全方位為用戶著想為用戶服務，積極推動庫內細胞資源的利用。,密切關注國際細胞生物學發(fā)展前沿，主動與醫(yī)院等單位合作，拓寬細胞資源的種類，為我國細胞

7、生物學的進一步發(fā)展做好準備。,我們的目標,2021/10/10,8,二，污染是細胞培養(yǎng)的大敵。保證細胞株不受污染是細胞庫保藏能力的關鍵性標志，也是其他能力提升的基礎,1,，細菌污染,2,，真菌污染,3,，支原體污染,4,，內毒素污染,5,，細胞間交叉污染,2021/10/10,9,1,，細菌污染。,實驗室中因操作不慎而引起的污染，即使在細胞培養(yǎng)液中加入了預防劑量的抗菌素也會產(chǎn)生。最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌，以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。培養(yǎng)細胞受細菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，,pH,改變。也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。

8、污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡，造成實驗失敗和細胞株,(,系,),丟失。,2021/10/10,10,2,，真菌污染,在細胞培養(yǎng)過程中較為常見，尤其在南方霉雨季節(jié)進行細胞培養(yǎng)更易產(chǎn)生。最常見的真菌有：煙曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。培養(yǎng)細胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色小點，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細胞周邊和細胞之間。,2021/10/10,11,3,，支原體污染,3.1,，支原體污染是目前實驗室中最為常見的污染細胞的原核生物。,

9、因支原體屬于直徑介于,0.2,左右的最小原核生物，形態(tài)易變，故極易通過濾膜而逃過培養(yǎng)液的過濾除菌步驟。在細胞培養(yǎng)液中，支原體可達到,10,7,-10,8,CFU/mL,（,CFU=Colony Forming Unit,，支原體濃度測量單位）而不使培養(yǎng)液混濁及影響細胞生長。多種支原體對細胞不產(chǎn)生任何病變效應，使得細胞污染不易被察覺。據(jù)報道，目前世界上有,30-50%,的細胞株已受支原體污染。但是支原體對干細胞培養(yǎng)的影響甚大，胚胎干細胞受支原體污染形態(tài)、生長速度等均出現(xiàn)改變。,在細胞培養(yǎng)過程中如果在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)破碎的細胞很多，需要頻繁換液才能維持傳代培養(yǎng)的時候，即應懷疑支原體污染。,2021/1

10、0/10,12,由于多數(shù)細胞受支原體污染后無明顯變化或略有變化，若不及時處理，將產(chǎn)生交叉污染。另外，支原體會改變宿主細胞的結構和功能等一系列特征，因此盡管很多受支原體污染的細胞其形態(tài)看不出變化，但對其進行進一步分子生物學分析時，其實驗結果會不準確。為此建議各實驗室定期對細胞進行支原體檢查。,可污染細胞的支原體種類較多，主要有,Mycoplasma orale,M.hyorhinis,M.arginini,和,Acholeplasma laidlawii,。目前已發(fā)現(xiàn)的支原體超過,100,種，這就是單一的檢測方法有時會失敗的原因之一。我們建議至少選擇,2,種方法來檢測支原體。,2021/10/1

11、0,13,3.2,，常用支原體檢測方法,3.2.1,，肉湯培養(yǎng)基檢測法。醫(yī)藥行業(yè)規(guī)定使用。,3.2.2,，間接染色法檢測支原體,用待檢測的細胞培液培養(yǎng),Vero,細胞，然后用顯微鏡觀察是否有支原體感染。,Vero,細胞來源于正常的成年非洲綠猴腎組織，由,Y.Yasumura,和,Y.Kawakita,于,1962,年在日本,Chiba,大學分離得到。,Vero,細胞是非整倍體，可在培養(yǎng)液中無限生長，常用來生產(chǎn)疫苗，檢測支原體和細菌外毒素等。細胞培養(yǎng)液中的支原體可用,Hoechst33258,或,DAPI,染色后觀察到。由于支原體含有,DNA,，染色后在細胞表面，培養(yǎng)基中及培養(yǎng)皿表面呈現(xiàn)出熒光小

12、點。,2021/10/10,14,Vero,細胞,DAPI,染色熒光照片,(400),。,A,，感染支原體的,Vero,細胞。藍色卵圓形熒光物質為,Vero,細胞核，其周圍藍色熒光小點為支原體,(,箭頭,),；,B,，未感染支原體的陰性對照,Vero,細胞；,C,，加入待檢培養(yǎng)液的,Vero,細胞,(,未感染支原體,),。,A,B,C,間接染色法檢測支原體,2021/10/10,15,3.2.2,，,PCR,法檢測支原體,許多支原體檢測方法不僅用時長而且復雜，有的方法僅限于檢測有限種類的支原體。,PCR,檢測法靈敏度高，特異性強，只用一天時間即可快速檢測細胞培養(yǎng)液中的支原體，是一種檢測支原體的

13、有效手段。中科院干細胞庫選擇支原體,16S rDNA,序列為靶序列設計引物，同時做對照組實驗和干擾實驗以避免假陽性或假陰性結果，取得了很好的效果。,2021/10/10,16,PCR,法支原體檢測電泳圖。,+,：陽性對照；,-,：陰性對照；,1,：送檢樣品,1,（感染支原體）；,2,：送檢樣品,2,（未感染支原體）；,3,：樣品,1,的干擾實驗；,4,：樣品,2,的干擾實驗。若在,270bp,處有條帶，檢測結果為陽性。陽性對照及干擾實驗,PCR,產(chǎn)物在,270bp,處有一條帶，陰性對照無條帶，證明本次實驗準確可靠。,600bp,400bp,500bp,200bp,300bp,100bp,Mar

14、ker +-1 2 3 4,PCR,法檢測支原體,2021/10/10,17,預防：,1.,支原體噴霧（品牌：,Biochrom),：噴于操作臺和培養(yǎng)箱,2.Plasmocin prophylactic,（品牌：,InvivoGen,）：作用濃度為,5g/ml,作用于常規(guī)的細胞培養(yǎng)基（,500 x,稀釋）,去除：,Plasmocin treatment,（品牌：,InvivoGen,）：作用濃度為,25g/ml,，作用于感染的培養(yǎng)細胞基兩周（,1000 x,稀釋）。,3.3,，支原體污染的預防和去除,2021/10/10,18,4.1,，細菌內毒素對培養(yǎng)物的危害：,實驗證明，細菌內毒素對培養(yǎng)細

15、胞（尤其是,ES,細胞）的生長及活性具有明顯的抑制作用,且該作用具有一定的時間、劑量依賴性。,4.2,，細胞培養(yǎng)中內毒素的來源：,細胞培養(yǎng)基中的主要天然成份,-,牛血清包括胎牛血清和新生牛血清是內毒素的潛在來源。我國,2000,年版,中國生物制品主要原輔料質控標準,中對牛血清提出比較嚴格的標準要求。包括蛋白質含量，細菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細菌內毒素，支持細胞增殖檢查等等。對于胚胎干細胞培養(yǎng)，,LIF,和,bFGF,是細菌內毒素的另一個潛在來源。,4,，內毒素污染,2021/10/10,19,4.3,，細胞培養(yǎng)中內毒素的監(jiān)控：,為排除血清、,LIF,和,bFGF,中內毒素的污

16、染，細菌內毒素檢測是非常重要的。中國科學院干細胞庫只使用細菌內毒素小于,1EU/ml,的血清、,LIF,和,bFGF,等各種生長因子。,4.4,，內毒素監(jiān)控是細胞用于臨床治療所必須的。,目前各類臨床級干細胞尚無統(tǒng)一的國際、國內標準，這是胚胎干細胞進入實際應用階段的最大障礙之一，也是細胞庫水平的一個重要標志。但是在制藥工業(yè)中內毒素是必須去除的。因此，中國科學院干細胞庫強調高標準嚴要求，把內毒素監(jiān)控作為細胞培養(yǎng)的常規(guī)標準。,2021/10/10,20,鱟試劑凝膠半定量法檢測（參考,2010,年版,中國藥典,）,4.5,，內毒素檢測方法,鱟試劑：鱟科動物東方鱟的血液變形細胞溶解物的無菌冷凍干燥品，含有能被微量細菌內毒素激活的凝固酶原（,Proclotting enzyme,）和凝固蛋白原（,Coagulogen,）。在適宜的條件下（溫度，,pH,值及無干擾物質），細菌內毒素激活鱟試劑中的凝固酶原，使鱟試劑產(chǎn)生凝集反應形成凝膠。凝膠法鱟試劑是根據(jù)反應所形成凝膠的程度來檢測樣品內內毒素的含量。,2021/10/10,21,5,，細胞間交叉污染,Hela,細胞是第一株源細胞系。,1952,年建系以