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西 省 食 品 安 全 地 方 標 準 012— 2016 食品安全地方標準 蜂蜜中 16 種激素殘留的測定 液相色譜 質(zhì)譜法 2016施 2016布 陜西省衛(wèi)生和計劃生育委員會 發(fā)布 012— 2016 I 前 言 本標準按照 本標準由中華人民共和國陜西出入境檢驗檢疫局提出。 本標準由中華人民共和國陜西出入境檢驗檢疫局負責起草。 本標準主要起草人：張璐，李瑩，何強，王菡，孔祥虹，鄒陽，付騁宇。 本標準屬首次發(fā)布。 012— 2016 1 食品安全地方標準 蜂蜜中 16 種激素殘留的測定 液相色譜 質(zhì)譜法 1 范圍 本標準規(guī)定了蜂蜜中 16種激素殘留的 液相色譜 質(zhì)譜（ S）的檢測方法。 本標準適用于蜂蜜中糖皮質(zhì)激素（曲安西龍、潑尼松龍、氫化可的松、甲基潑尼松龍、地塞米松、氟米松、曲安奈德、醋酸氟氫松、氟氫可的松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、醋酸潑尼松）、雄性激素（甲睪酮、睪酮）、孕激素（孕酮）、腎上腺皮質(zhì)激素（羥基醋酸去皮質(zhì)酮） 16種激素 殘留定性和定量測定。 2 規(guī)范性引用文件 下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 準化工作導(dǎo)則 第 1部分：標準的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法 3 原理 試樣經(jīng)酶解，用乙腈提取目標化合物后，經(jīng)固相萃取富集凈化，液相色譜 質(zhì)譜儀測定，外標法定量。 4 試劑與材料 除非另有說明，在分析中僅使用確認為分析純的試劑和 6682中規(guī)定的一級水。 乙腈 ：色譜純。 甲醇 ：色譜純。 甲酸 ：色譜純。 二氯甲烷。 乙酸銨。 乙酸。 ?芳香基硫酸酯酶（ ? 含有 ?34600 U/基硫酸酯酶 5200 U/ 無水硫酸鈉： 650 ℃灼燒 4 h，在干燥器中冷卻至室溫，貯于密封瓶中備用。 乙酸銨溶液（ 0.2 ）： 稱取 15.4 g 乙酸銨，加入 1000 溶解，用乙酸調(diào)節(jié) 012— 2016 2 二氯甲烷 6+4，體積比）： 60 氯己烷和 40 醇混合 。 甲酸水溶液： 準確量取 1 酸加水稀釋至 1000 乙腈 1+9，體積比）： 10 腈和 90 混合。 標準品 ：曲安西龍、潑尼松龍、氫化可的松、甲基潑尼松龍、地塞米松、氟米松、曲安奈德、醋酸氟氫松、氟氫可的松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、醋酸潑尼松龍、甲睪酮、睪酮、孕酮、醋酸去氧皮質(zhì)酮，純度均大于 97 %，物質(zhì)英文名稱及 見附錄 A。 標準儲備液（ 1 mg/：分別準確稱 10.0 標準品于 10 量瓶中，用甲醇溶解，搖勻， 避光保存，可保存 12 個月。 混合標準中間溶液（ 1 ?g/： 分別準確量取 1 mg/準儲備液各 25 量瓶中，用水溶解， 0 ℃～ 4 ℃避光保存，可保存 6 個月。 混合標準使用溶液 ： 根據(jù)需要，臨時吸取一定量的混合標準中間溶液（ 水稀釋，配制成適當濃度的標準工作溶液 0 ℃～ 4 ℃避光保存，可保存 6 個月 。 60 3 ：使用前依次用 6 甲醇（ 6 6 氨基固相萃取柱 （ 60 3 ：使用前用 6 甲醇（ 化。 5 儀器與設(shè)備 液相色譜 配電噴霧離子源 。 分析天平： 感量 天平： 感量 g。 振蕩器 渦旋混勻器 高速離心機 固相萃取裝置 氮吹儀 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 離心管： 50 有機系濾膜： m。 6 試 樣制備與保存 對無結(jié)晶的實驗室樣品，將其攪拌均勻。對有結(jié)晶的樣品，在封閉情況下，置于不超過 60℃的水浴中溫熱，震蕩，待樣品全部融化后攪勻，迅速冷卻至室溫，分出 0.5 備好的樣品置于樣品瓶中，密封，并做上標記。 012— 2016 3 7 測定步驟 提取 準確稱取試樣 5 g（精確至 g），于 50 入 20 .2 乙酸銨溶液（ 渦旋混合，再加入 ?芳香基硫酸酯酶 100 ?L，于 37 ℃± 1℃震蕩酶解 12 h。取出冷卻至室溫，加入 20 5 4500 r/ 乙腈層過無水硫酸鈉漏斗。再加入 15 復(fù)上述提取過程。合并乙腈層， 40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用 10 .2 乙酸銨溶液（ 解，待凈化。 凈化 提取液（ 1.5 mL/將小柱減壓抽干。再將活化過的氨基柱（ 聯(lián)在 8 甲醇（ 脫并收集洗脫液，取下 用 2 甲醇（ 氨基柱，合并洗脫液，于 40℃ 氮氣吹干，用 1 水（ 解殘渣，渦旋混勻，濾膜（ 濾，供液相色譜 測定 液相色譜條件 色譜柱： 00 m） , 或相當者； 柱溫： 40℃ ； 流速： 0.3 mL/ 進樣量： L; 流動相：乙腈 甲酸水，梯度洗脫，洗脫條件參見附錄 B； 糖皮質(zhì)激素質(zhì)譜條件 a）電離源：電噴霧離子源； b）離子化方式：負離子模式； c）檢測模式：選擇離子反應(yīng)監(jiān)測； d）噴霧電壓： 2500 V； e）氣化溫度： 300 ℃； f）鞘氣（ ； g）輔助氣（ : ； h）離子傳輸管溫度： 300 ℃； i）去簇電壓： ； j）碰撞氣（ k）特征離子參見附錄 雄性激素、孕激素、腎上腺皮質(zhì) 激素質(zhì)譜條件 a）電離源：電噴霧離子源； b）離子化方式：正離子模式； c）檢測模式：選擇離子反應(yīng)監(jiān)測； d）噴霧電壓： 3300 V； e）氣化溫度： 300 ℃； f）鞘氣（ ； 012— 2016 4 g）輔助氣（ : ； h）離子傳輸管溫度： 300 ℃； i）去簇電壓： ； j）碰撞氣（ pa k）特征離子參數(shù)見附錄 C. 2。 測定法 性測定 通過試樣色譜圖的保留時間與相應(yīng)標準品的保留時間、各色譜峰的特征離子與響應(yīng)濃度標準溶液各色譜峰的特征離子相對照定性，試樣與標準品保留時間的相對偏差不大于 5 %；試樣特征離子的相對豐度與濃度相當混合標準溶液的相對豐度一致，相對豐度允許偏差不超過表 1的規(guī)定，則可判斷試樣中存在相應(yīng)的被測物。 表 1 試樣溶液中離子相對豐度的允許偏差范圍 相對豐度 （ %） ＞ 50 ＞ 20～ 50 ＞ 10～ 20 ≤ 10 允許偏差 （ %） ±20 ±25 ±30 ±50 量測定 根據(jù)試樣中被測樣液的含量情況，按外標法，以峰面積定量。選取待測物的響應(yīng)值在儀器線性響應(yīng)范圍內(nèi)的濃度進行測定，如果超出儀器線性響應(yīng)范圍應(yīng)進行稀釋。在上述條件下，標準溶液中各目標化合物的特征離子流色譜圖見附錄 D。 行試驗 按照 白試驗 除不稱取試樣外， 均按 8 結(jié)果計算和表達 試樣中各目標化合物殘留量（ ?g/按式 （ 1） 計算： ……………………………… (1) 式中： X— 供試試樣中各目標化合物殘留量，單位為微克每千克（ ?g/ A— 試樣溶液中各目標化合物的峰面積； 標準工作溶液中各目標化合物的濃度，單位為微克每升（ ?g/L）； V— 樣液最終定容體積，單位為毫升（ 標準工作溶液中各目標化合物的濃度，單位為微克每升（ ?g/L）； m— 試樣質(zhì)量，單位為克（ g）。 注：計算結(jié)果需扣除空白值，測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示，保留兩位有效數(shù)字。 9 定量限、回收率和精密度 檢出限 012— 2016 5 本方法 曲安西龍、潑尼松龍、氫化可的松、甲基潑尼松龍、地塞米松、氟米松、曲安奈德、醋酸氟氫松、氟氫可的松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、甲睪酮、睪酮、孕酮、醋酸去氧皮質(zhì)酮 檢出限均為 g /酸潑尼松檢出限為 g / 回 收率 蜂蜜中各種激素 的回收率試驗數(shù)據(jù)見附錄 E，在 g/~。 精密度 本方法的相對標準偏差 ≤ 15 %。 012— 2016 6 附 錄 A （規(guī)范性附錄） 16 種激素物質(zhì)的 、分子式、分子量及英文名稱 6 種激素物質(zhì)的 、分子式、分子量及英文名稱 應(yīng)符合表 表 化合物 分子式 分子量 醋酸潑尼松龍 223酸可的松 023尼松龍 021化可的松 021基潑尼松龍 322酸地塞米松 581224塞米松 022安西龍 2421米松 13522氫可的松 27安奈德 Triamcinolon