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1、幾種測定生物大分子分子量方法的比較 摘要：生物大分子是指核酸(多核苷酸)、蛋白質(zhì)(多肽)、碳水化合物(葡聚糖或多糖)和脂類等。因?yàn)榉肿恿啃∮?00的單體可以通過聚合作用形成的大分子。測定生物大分子分子量方法是生物研究的核心之一，分子量是多肽、蛋白質(zhì)、核酸、酶、多糖以及脂類等鑒定中的首要參數(shù)。當(dāng)前醫(yī)學(xué)，藥學(xué)及生物科學(xué)學(xué)科之間交叉滲透為測定生物大分子分子量提供了更多的契機(jī)，本文對測定生物大分子分子量的方法：生物質(zhì)譜法，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠滲透色譜法等技術(shù)的原理及優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行綜述。 關(guān)鍵字：生物大分子 分子量測定 蛋白質(zhì) 多肽 21世紀(jì)是生命科學(xué)的世紀(jì)，隨著人類基因組，水稻基

2、因組等的測序基本完成，蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)基因組研究也迅速發(fā)展。負(fù)責(zé)生命活動的是生物大分子，生物大分子之間的相互作用構(gòu)成了生命活動的基礎(chǔ)，因此，測定生物大分子的分子量，深入了解生物大分子的結(jié)構(gòu)功能是掌握生命活動的關(guān)鍵。生物大分子是細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)和功能單位,也是研究生命現(xiàn)象中的物質(zhì)基礎(chǔ).生物體內(nèi)的分子組成如何?哪些分子才算生物大分子?這些大分子有沒有分子量的下限?怎么去測定生物大分子分子量？要想知道這些答案，需要多方位，運(yùn)用多種方法進(jìn)行研究。 1. SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 采用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳方法可對蛋白質(zhì)的組分進(jìn)行分離，并可精確測得蛋白質(zhì)的分子量，常用的方法為SDS—PAGE不

3、連續(xù)系統(tǒng)。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理：聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺和N，-亞甲基雙丙烯酰胺經(jīng)共聚合而成，此聚合過程是由四甲基乙二胺和過硫酸胺激發(fā)的，被激活的單體和未被激活的單體開始了多聚鏈的延伸，正在延伸的多聚鏈也可以隨機(jī)地接上雙丙烯酰胺，使得多聚鏈交叉互連成為網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)，最終多聚鏈聚合成凝膠狀。 在一定條件下，蛋白質(zhì)，多肽在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和核酸在聚丙烯酰胺凝膠電泳及瓊脂糖凝膠電泳中，其分子量與電泳遷移率符合的關(guān)系。在精確測定與計(jì)算相對遷移率時(shí)，要求分別測定樣品區(qū)帶中心及指標(biāo)劑染料區(qū)帶中心(通常插入銅絲作為標(biāo)記)與凝膠頂端(聚丙烯酰胺凝膠電泳)或點(diǎn)樣孔(瓊脂糖凝膠電泳)間的距離

4、。SDS是十二烷基硫酸鈉的簡稱，它是一種陰離子表面活性劑，加入到電泳系統(tǒng)中能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上（在一定條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合比為1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)），使各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而使其電泳遷移率只取決于分子大小這一因素，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)和遷移率所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可求得未知物的分子量。 SDS -PAGE電泳法是實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用最普遍的方法,分為還原電泳和非還原電泳,非還原電泳中二硫鍵未打開,還原電泳中二硫鍵被還原,蛋白質(zhì)分子能充分伸展,兩者相比,還原電泳的測定結(jié)果更為準(zhǔn)確。

5、 優(yōu)缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)成本較低，樣品用量少，時(shí)間短，操作簡單，儀器設(shè)備也相對很簡單，一套電泳裝置即可，分辨率高。但是精確程度相對較低，好的電泳圖譜需要一定的技術(shù)。 2. 凝膠滲透色譜（GPC） GPC是一種用溶劑作流動相，多孔性填料或凝膠作為分離介質(zhì)的柱色譜，主要根據(jù)溶液中分子體積( 或稱分子的流體力學(xué)體積 )大小的不同作為分離基礎(chǔ)，使被分離樣品按分子量大小先后流出色譜柱。凝膠床由多孔溶脹凝膠組成，當(dāng)樣品通過色譜柱時(shí)，物質(zhì)在柱中受到固定相的阻滯作用，分子量大的不能滲入凝膠顆粒，只能沿溶脹凝膠顆粒間的孔隙隨溶劑流動，受到的阻滯作用小，移動速度快，流程短而先流出色譜柱；分子量小的將滲入凝膠顆粒，受到的

6、阻滯作用大，移動流速慢，流程長而較后流出色譜。 優(yōu)缺點(diǎn)：凝膠滲透色譜法分離速度快，分析時(shí)間短，重復(fù)性好，進(jìn)樣量少，自動化程度高，但設(shè)備投入大，價(jià)格較高。 3.質(zhì)譜技術(shù) 3.1 MALDI—TOF質(zhì)譜技術(shù) 對熱敏感的化合物進(jìn)行快速加熱，可以避免其受熱分解而轉(zhuǎn)入氣相，所以進(jìn)行質(zhì)譜法分析，采用MALDI—TOF法尤為適用，測定的化合物相對分子質(zhì)量可達(dá)數(shù)十萬。MALDI—T0F的應(yīng)用范圍廣泛，包括有機(jī)小分子、有機(jī)高聚物和生物大分子。它在生物大分子領(lǐng)域的應(yīng)用尤為引人注目。 基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)是將分析物分散在基質(zhì)分子中并形成晶體，當(dāng)用激光照射晶體時(shí)，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導(dǎo)

7、致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，致使基質(zhì)和分析物膨脹并進(jìn)入氣相。MALDI所產(chǎn)生的質(zhì)譜圖多為單電荷離子，因而質(zhì)譜圖中的離子與多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量有一一對應(yīng)關(guān)系。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)檢測器的飛行時(shí)間不同，導(dǎo)致測定離子的質(zhì)荷比（M/Z）與離子的飛行時(shí)間成正比。MALDI產(chǎn)生的離子常用飛行時(shí)間(time—of—flight，TOF)檢測器來檢測，理論上講，只要飛行管的長度足夠，TOF檢測器可檢測分子的質(zhì)量數(shù)是沒有上限的，因此MALDI—TOF質(zhì)譜很適合對蛋白質(zhì)、多肽、核酸和多糖等生物大分子分子量進(jìn)行測量測。 3.1.1測定多肽與蛋白質(zhì)分析 生物工程產(chǎn)品中多

8、肽與蛋白質(zhì)是最主要的產(chǎn)品類型，對這些生物工程產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制，已成為當(dāng)前一個(gè)很重要的課題。MALDI—TOF已廣泛用于多肽與蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確測定及其純度的評價(jià)。傳統(tǒng)的測定，純度及肽圖的方法，應(yīng)用凝膠電泳及高效液相色譜，這些方法不僅受多種實(shí)驗(yàn)條件(如色譜柱、流動相的選擇等)所限，而且誤差大，往往難以得到令人滿意的結(jié)果，且操作十分復(fù)雜。 應(yīng)用MALDI—TOF對生物工程產(chǎn)品進(jìn)行準(zhǔn)確的，純度及質(zhì)量肽圖進(jìn)行測定。對一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證，得到了直觀、準(zhǔn)確(誤差小于0.2％)的結(jié)果。這方面的報(bào)道不勝枚舉，牛碳酸酐酶、蜂毒素、牛胰島素、肌 紅蛋白、胰蛋白酶原等都已經(jīng)成功測定，測定過程簡便快速。 3.1.2測定多

9、糖 近年來，人們對糖類化合物的生理功能有了新的認(rèn)識，糖類化合物繼蛋白質(zhì)、核酸之后，成為生命科學(xué)領(lǐng)域中的又一研究熱點(diǎn)。糖的性質(zhì)與其大小密切相關(guān)，因此糖特別是多糖分布的測定，在糖類化合物的研究和應(yīng)用中有著重要的意義。傳統(tǒng)的多糖測定方法，如滲透法、黏度法、光散射法、凝膠色譜法等，不僅耗樣多、誤差大或受分子形狀的影響，且各方法所測的性質(zhì)不同，需要幾種方法配合使用很不方便。而糖本身高極性、難揮發(fā)的性質(zhì)以及多糖較高的和其的發(fā)散，使糖類物質(zhì)的質(zhì)譜表征比較困難。但MALDI—TOF在這一領(lǐng)域顯示出一定潛力和應(yīng)用前景。 在測定多糖時(shí)，往往得不到高質(zhì)量區(qū)，主要是聚合度低的分子優(yōu)先電離的趨勢抑制高，的多糖離子化

10、過程。用凝膠柱處理過的多糖，分布范圍變小，得到MALDI譜圖效果變好。多糖的正、負(fù)離子基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MAIDI．MS)圖譜已無明顯差別。這意味著寡糖、多糖的離子化過程可能不同于寡糖在激光解吸／電離過程，離子的形成主要是中性分子熱蒸發(fā)并隨后形成陽離子化的過程。隨著的增加，這種熱力學(xué)解吸過程越來越困難。對高多糖來說，電離主要是依靠激光解吸／電離的集合作用完成的，大量基質(zhì)分子共振吸收激光能量后，通過集合作用使基質(zhì)和供試品的固體溶液發(fā)生解聚，產(chǎn)生帶有隨機(jī)電荷量的分子簇和團(tuán)粒，并在向真空蒸發(fā)過程中冷卻，留下帶電荷的大供試品離子。這種情況下，正、負(fù)離子生成幾率差不多，使得多糖的正、負(fù)離子MAl

11、JDT—TOF譜比較接近。綜上所述，糖類化合物輔助激光解吸／電離的離子化過程與其大小 有關(guān)。低時(shí)，熱力學(xué)過程占主導(dǎo)地位；高時(shí)，非熱力學(xué)過程占主導(dǎo)地位，這兩種過程的差異，導(dǎo)致了寡糖和多糖正負(fù)離子MALDI—TOF譜圖的差異。此結(jié)論顯示出MALDI—TOF對多糖的應(yīng)用還需探索。 3.1.3測定核苷酸 核苷酸也是具有極其重要生理功能的大分子物質(zhì)，極性大，熱不穩(wěn)定，與蛋白質(zhì)類似，MALDI—TOF在對核苷酸的測定方面，顯示巨大潛力。用酶解法與MALDI—TOF分析結(jié)合，可測定較多堿基的核苷酸的堿基序列。MALDI—TOF對固相合成法合成的大分子核苷酸進(jìn)行了測定。準(zhǔn)確表征了其合成的功效。 MALD

12、l—TOF與傳統(tǒng)的磁式質(zhì)譜相比，其特點(diǎn)有①可實(shí)現(xiàn)納秒量級的瞬時(shí)記錄，經(jīng)過多次瞬時(shí)記錄累加得到的質(zhì)譜圖，其信噪比得到了極大的改善。②具有高的離子流通率，因而獲得高的靈敏度，僅需約lpmol的供試品即可測定。③原則上沒有范圍限制。 質(zhì)譜分析用于蛋白質(zhì)等生物活性分子的研究具有如下優(yōu)點(diǎn)：很高的靈敏度能為亞微克級試樣提供信息，能最有效地與色譜聯(lián)用，適用于復(fù)雜體系中痕量物質(zhì)的鑒定或結(jié)構(gòu)測定，同時(shí)具有準(zhǔn)確性、易操作性、快速性及很好的普適性，提供樣品分子的相對分子質(zhì)量和豐富的結(jié)構(gòu)信息，可用于大規(guī)模高通量分離分析和檢測。它以其高靈敏度、低供試 品消耗量、能確立分子式等優(yōu)點(diǎn)，在現(xiàn)代儀器分析中發(fā)揮著 越來越重要的

13、作用。 綜上所述，MALDI—TOF作為一個(gè)新技術(shù)，它已經(jīng)成為測定生物大分子的重要方法，尤其是蛋白組的研究中，可以鑒定細(xì)胞有哪些蛋白質(zhì)組，是不可缺少的方法 3.2 電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù) 電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)(electrospray ionization mass spec— trometry，ESI—MS)是在毛細(xì)管的出口處施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場使從毛細(xì)管流出的液體霧化成細(xì)小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強(qiáng)度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個(gè)或多個(gè)電荷的離子，致使分析物以單電荷或 多電荷離子的形式進(jìn)入氣相。電噴霧離子化的特點(diǎn)是產(chǎn)生高電荷離子而不是碎片離子，使質(zhì)量電荷比（m

14、/z）降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器都可以檢測的范圍，因而大大擴(kuò)展了分子量的分析范圍，離子的真實(shí)分子質(zhì)量也可以根據(jù)質(zhì)荷比及電荷數(shù)算出。 電噴霧電離質(zhì)譜的優(yōu)勢在于它能方便地與多種分離技術(shù)聯(lián)合使用，如液—質(zhì)聯(lián)用(LC—MS)是將液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合而達(dá)到檢測大分子物質(zhì)的目的。 優(yōu)缺點(diǎn)：（1）對樣品的消耗少，不會造成樣品的大量浪費(fèi)（2）對樣品分子質(zhì)量測試的靈敏度，分辨力和準(zhǔn)確度都相當(dāng)高（3）能夠方便地與多種分離技術(shù)聯(lián)用，如毛細(xì)管電泳，高效液相色譜等，是解決非揮發(fā)性，熱不穩(wěn)定性，極性強(qiáng)的復(fù)雜組分化合物的定性定量的高靈敏度檢測方法。 3.3 FT Orbitrap（傅立葉變換靜電場軌道阱） 在1999年的A

15、SMS上，質(zhì)譜學(xué)家Alexander Makarov 報(bào)告用一種新的質(zhì)量分析器靜電場軌道阱進(jìn)行高分辨和精確質(zhì)量數(shù)測量。第一臺Orbitrap質(zhì)譜儀誕生于2001年，在愛丁堡大學(xué)的實(shí)驗(yàn)室使用。Orbitrap 是近20多年來質(zhì)量分析器的突破性技術(shù)。這是一種采用新結(jié)構(gòu) 質(zhì)量分析器和突破性技術(shù)的質(zhì)譜儀器，離子在質(zhì)量分析器里作軌道旋轉(zhuǎn)和振蕩，Orbitrap 質(zhì)譜儀的檢測方式是通過離子的旋轉(zhuǎn)振蕩產(chǎn)生的鏡像電流，經(jīng)微分放大后由FT變換器轉(zhuǎn)換為各離子的振蕩頻率，最后計(jì)算出分子離子的質(zhì)核比(m/z)。這種通過頻率來測量質(zhì)核比的方式，可以得到超高的分辨率，Orbitrap的質(zhì)量分辨率介于FTICR（傅立葉變換

16、離子回旋共振質(zhì)譜）和TOF（飛行時(shí)間質(zhì)譜)之間,最高分辨率可達(dá)到10萬。 Orbitrap的工作原理：質(zhì)量分析器形狀如同仿棰體，由仿棰形中心內(nèi)電極和左右2個(gè)外仿棰半電極組成。Orbitrap對離子的操作步驟分為離子捕獲、旋轉(zhuǎn)運(yùn)動、軸向振動和鏡像電流檢測。儀器工作時(shí)，在中心電極逐漸加上直流高壓，在Orbitrap內(nèi)產(chǎn)生特殊幾何結(jié)構(gòu)的靜電場。當(dāng)離子進(jìn)入到Orbitrap室內(nèi)后，受到中心電場的引力，即開始圍繞中心電極作圓周軌道運(yùn)動，m/z 高的離子有較大的軌道半徑。同時(shí)離子受到垂直方向的離心力和水平方向的推力，而沿中心內(nèi)電極作水平和垂直方向的震蕩。外電極除限制離子的運(yùn)行軌道范圍，同時(shí)檢測由離子振蕩

17、產(chǎn)生的感應(yīng)電勢，其中水平震蕩的頻率和分子離子的質(zhì)荷比(m/z)的關(guān)系可由以下數(shù)學(xué)公式來描述，可見軸向頻率與離子的初始狀態(tài)是無關(guān)的,這種不相關(guān)性造就 Orbitrap 具有高分辨率和高質(zhì)量準(zhǔn)確度的特性。從 Orbitrap 的每個(gè)外電極輸出的時(shí)域信號經(jīng)過微分放大器放大后由快速傅立葉轉(zhuǎn)換變成頻域譜，頻域譜再進(jìn)而轉(zhuǎn)換為質(zhì)譜，然后在 Xcalibur 質(zhì)譜軟件中處理輸出。 質(zhì)譜方法是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)，質(zhì)譜數(shù)據(jù)可提供蛋白質(zhì)的分子量、氨基酸序列、翻譯后修飾及位點(diǎn)、差異蛋白比較等信。LTQ Orbitrap Velos 可對蛋白質(zhì)酶切后的眾多肽段的精確分子量和二級質(zhì)譜同時(shí)測定，再經(jīng)過數(shù)據(jù)庫檢索，得

18、到蛋白質(zhì)組的高通量鑒定。Orbitrap 質(zhì)量分析器使得代謝組學(xué)的整體研究手段得以進(jìn)一步簡化。例如，LTQ Orbitrap 的分辨率使得色譜分離過程大大精簡。生物樣品可以被直接引入測定。 4. 沉降-擴(kuò)散法測定分子量(S-D法) 大分子在溶液里沉降所受溶劑分子的阻力和它們在溶液里擴(kuò)散時(shí)所受阻力相同時(shí)，沉降到達(dá)穩(wěn)速狀態(tài)?？傻玫絊vedberg公式: M:分子量 T:溶質(zhì)偏微比容 溶液密度 S:溶質(zhì)沉降系數(shù) T:絕對溫度 R:氣體擴(kuò)散常數(shù) D.溶質(zhì)擴(kuò)散系數(shù) 將相同實(shí)驗(yàn)條件下c濃度，溫度)實(shí)驗(yàn)測出的S, D,，P值代入公式，求出Mo粘度測定:Ubbelohde粘度計(jì)，測定樣品對

19、水的相對粘度。密度測定:比重瓶法(lOml)。偏微比容測定:比重瓶法(lOml)。稱量精確至，溶液濃度準(zhǔn)確至。依據(jù)公式:，溶液比容，溶劑比容，表觀偏微比容)。沉降系數(shù)測定同前。擴(kuò)散系數(shù)測定:用032-0381雙槽毛細(xì)管型合成界面池。樣品量0.15m1，另一側(cè)加滿溶劑。測定溫度與S值測定時(shí)相同實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格控制溫度恒定。轉(zhuǎn)速視樣品分子大小而定，一般為6000-7000r.P.m。記錄界面剛合成時(shí)的時(shí)間、相角、定時(shí)拍攝Schlieren圖譜，拍攝間隔先緊后疏。 拐點(diǎn)法計(jì)算結(jié)果:照片上圖形(圖1)縱軸以Y表示，橫軸以X表示。F為X軸向的放大倍數(shù)。從照片上量出Y最大值(峰高)，根據(jù)Yi= Y最大，

20、求出，量出對應(yīng)于的兩個(gè)值(拐點(diǎn))間距離。以對時(shí)間作圖，將求得斜率代入公式，，得到D值。 圖1 0.5％葡聚糖界面擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)之Schlieren圖譜 總結(jié) SDS -PAGE 電泳法是實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用最普遍的方法,成本低，操作簡單，但是精確程度相對較低，高質(zhì)量的電泳圖譜需要一定的技術(shù)。高效凝膠過濾色譜測定分子量時(shí)，對標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)與待測蛋白質(zhì)分子形狀的一致性要求較高 ,只有兩者的分子形狀一致時(shí)(均為球型), 測定結(jié)果才可靠；如分子形狀差別較大，測定結(jié)果不太準(zhǔn)確，它最大的特點(diǎn)就是重復(fù)性好，但是價(jià)格比較昂貴。MALDl—TOF具有很高的靈敏度能為亞微克級試樣提供信息，能最有效地與色譜聯(lián)用，

21、準(zhǔn)確度高分子量范圍大，掃描速度快，儀器結(jié)構(gòu)，簡單分辨率低的特點(diǎn)。但是TOF 的實(shí)際操作分辨率 (<30000) 和其它性能是這些高分辨質(zhì)譜中相對較低的，且測量結(jié)果的準(zhǔn)確性受操作條件影響大，主要表現(xiàn)為需要恒定的環(huán)境溫度，樣品分析時(shí)要添加內(nèi)標(biāo)實(shí)時(shí)校正,相對麻煩。相比Orbitrap的這種儀器，儀器比較大型，搬運(yùn)比較困難，維護(hù)成本高。除了MALDl—TOF，的優(yōu)點(diǎn)，Orbitrap還具備體積比較小，方便攜帶使用，多功能，易操作，矯正周期長，基本一個(gè)月矯正一次，但是其昂貴的價(jià)格、高額的運(yùn)轉(zhuǎn)費(fèi)，Orbitrap使得這種高端質(zhì)譜儀難以在各領(lǐng)域，尤其被作為常規(guī)分析儀器被推廣，一直是為少數(shù)專家所掌握和用于研究

22、性實(shí)驗(yàn)室的高端應(yīng)用。電噴霧質(zhì)譜法是目前測定蛋白質(zhì)分子量最準(zhǔn)確的方法之一。比如牛胰蛋白酶的實(shí)際分子量是23290Da，質(zhì)譜的測定結(jié)果為 23293Da，系統(tǒng)誤差在 0.02％以內(nèi),但是質(zhì)譜儀價(jià)格昂貴，對于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室來說無法購買使用。沉降-擴(kuò)散法測定分子量(S-D法)的優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)成本較低，樣品用量少，時(shí)間短，操作簡單，儀器設(shè)備也相對很簡單，一套裝置即可，分辨率高，但缺點(diǎn)是精確程度相對較低。 參考文獻(xiàn) [1] 安超,薛文嬌,馬賽箭,丁浩.高效凝膠色譜法同時(shí)測定普魯蘭多糖生物合成過程中分子量和含量[J].食品研究與開發(fā),2018,39(07):143-148. [2] 劉子華,于學(xué)玲,

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